不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织的毒性效应

解华晓，钟利桥，吴路银，姚 凡,3，倪朝辉

(1.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部长江中上游渔业生态环境监测中心，武汉 430223；3.华中农业大学水产学院，武汉 430070)

十溴联苯醚(BDE-209)是一种广泛使用的阻燃剂[1]，属于持久性有机污染物，在环境中很难被降解，且具有生物累积性，并会通过食物链损害人体健康[2]。在水、土壤、沉积物、灰尘、鸟类、鱼类和哺乳动物等样品中均能检测出BDE-209[3-4]， BDE-209的毒性作用包括发育毒性[5-7]、甲状腺毒性[8,11]、生殖毒性[9-10]等。高浓度BDE-209可以杀死大部分太平洋鳕(Gadusmacrocephalus)精子[12]，暴露于BDE-209的斑马鱼(Daniorerio)亲本可以将BDE-209转移到子代并且可引起子代的发育毒性和甲状腺内分泌紊乱[13]。BDE-209会对黑头呆鱼(Pimephalespromelas)的肝脏造成肝脏细胞核空泡化[14]。欧盟委员会将BDE-209作为管控物质，并规定2019年3月2日之后，所有物品中BDE-209的质量分数不得超过0.1%[14]。

目前，有关BDE-209的毒性研究集中于特定单一环境条件下对生物的毒理影响。然而在自然条件下，鱼类的生殖发育与温度有很大关系[18]。温度作为重要的非生物因子不仅影响鱼类的生理活动，也对暴露在化学成分中的生物体的毒性反应有很强的响应。因此，有必要对不同温度下的环境污染物的毒理效应做进一步研究。本研究通过体外染毒的方式探讨不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织的毒性效应，为BDE-209对水生生物的毒理影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择健康的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)作为试验用鱼，试验所用草鱼购自仙桃养殖场，其体长为(17.41±0.63)cm，体重为(49.67±4.28)g，试验开始前试验鱼在水族箱中驯养两周，每天定时投喂饵料两次，取样前禁食一天。

试验所用BDE-209的纯度大于95%(AccuStandard，美国)，二甲亚砜(DMSO)的纯度大于99%(国药集团化学试剂有限公司)，将BDE-209溶于DMSO配成1 mg/mL的母液，再按要求稀释成所需，避光保存。

试验所用仪器有超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技公司)、低温冷冻离心机(centrifuge 5415R，Eppendorf公司)，酶标仪(SYNERGY/2，bioTek公司)、分光光度计(UV-1800PC，biotech 公司)。

1.2 试验方法

试验设置15、25、35 ℃三种温度，每个温度组BDE-209设置四个浓度梯度，分别为0.00、0.04、4.00、400.00 μg/L，每组设六个重复。草鱼肝脏组织匀浆液的制备：取驯养后的健康草鱼幼鱼约30尾，用纱布擦干其表面后，解剖取其肝脏组织，在4 ℃的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸擦干后对肝脏组织称重，按1∶9(w/v)的比例加入生理盐水(4 ℃)，用眼科剪剪碎组织后超声波匀浆，制成质量分数10%的组织匀浆液。混匀后分装在72个2 mL EP管中，每管1.5 mL(匀浆液制备及加污染物过程均在冰浴中进行)，加入不同浓度的BDE-209混匀后分别置于15、25、35 ℃的水浴锅中孵育60 min，然后低温离心取上清分装，-80 ℃冰箱中保存，用于各指标的测定。

SOD、CAT、GR以及MDA测定参照试剂盒(购自南京建成生物研究所)说明书进行。

1.3 数据处理

实验数据采用统计学方法处理。结果以平均值±标准差(mean±SD)的形式来体现，同时用One-Way ANOVA方差分析进一步分析(SPSS 13.0)，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织SOD活性的影响

低温时(15 ℃)BDE-209各浓度组与对照组无显著性差异，常温时(25 ℃)4.00 μg/L BDE-209染毒的肝脏组织SOD活性与对照组相比显著性升高；高温时(35 ℃)0.04 、4.00、400.00 μg/L浓度组与对照组相比SOD活性显著性降低(图1)。

图1 不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织SOD活性的影响Fig.1 Effects of BDE-209 on SOD activity in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures数据表示为平均值±标准差(n=6)。下图同。

2.2 不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织CAT活性的影响

低温时(15 ℃)BDE-209各浓度组CAT活性呈现出先升高后降低的趋势，但差异性不显著；常温时(25 ℃)，0.04 μg/L 浓度组CAT活性与对照组相比极显著性升高、4.00 μg/L 浓度组CAT活性与对照组相比显著性降低,400 μg/L组CAT活性比对照组极显著降低。高温时(35 ℃)，各浓度组都比对照组CAT活性显著性降低(图2)。

图2 不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织CAT活性的影响Fig.2 Effects of BDE-209 on CAT activity in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures

2.3 不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织GR活性的影响

低温时(15 ℃)BDE-209各浓度组GR活性与对照组相比无显著变化，常温时(25 ℃)4.00 μg/L BDE-209暴露组GR活性与对照组相比呈显著性升高，400.00 μg/L BDE-209暴露组GR活性与对照组相比呈显著性降低，高温时(35 ℃)各BDE-209暴露组GR活性与对照组相比均呈显著性降低(图3)。

图3 不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织GR活性的影响Fig.3 Effects of BDE-209 on GR activity in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures

2.4 不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织MDA含量的影响

低温时(15 ℃)BDE-209浓度为400.00 μg/L时MDA含量显著升高；常温时(25 ℃)BDE-209浓度为4.00 μg/L、400.00 μg/L时MDA含量与对照组相比显著性升高；高温时(35 ℃)BDE-209浓度为0.04、4.00、400.00 μg/L时MDA含量与对照组相比显著升高(图4)。

图4 不同温度下BDE-209对草鱼离体肝脏组织MDA含量的影响Fig.4 Effects of BDE-209 on the content of MDA in isolated liver tissues of C.idellus at different temperatures

3 讨论

3.1 不同温度下BDE-209对草鱼幼鱼抗氧化酶的影响

通常情况下，生物体内氧自由基的生成与清除处于动态平衡。如果体内产生的自由基得不到及时有效的清除，就会通过损伤生物大分子破坏细胞的结构和功能，造成氧化损伤[19]，SOD和CAT组成鱼体抗氧化系统的第一道防线，对机体的氧化和抗氧化平衡起着非常重要的作用。GR主要是维持组织内还原态谷胱甘肽(GSH)的正常水平[20]，GSH是组织内重要的抗氧化剂，在解毒代谢过程中GSH会被氧化为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，而GR会重新催化GSSG还原为GSH[21]，所以GR在抗氧化体系中起重要作用。SOD、CAT、GR可以消除氧自由基以减少有害物质对机体的损伤[22]。在本研究中，不同浓度的BDE-209在相同的温度下SOD、CAT、GR活性趋势变化相似，在低温(15 ℃)时，BDE-209各浓度组酶活与对照组相比无显著性差异，在常温(25 ℃)时，SOD、CAT、GR活性均有先升高后降低的现象，而高温(35 ℃)处理下，各 BDE-209浓度组酶活性与对照组相比均显著性降低，白秀娟等[23]通过研究不同温度条件下文昌鱼(Branchiostomabelcheri)对铜离子和锌离子的耐受性也发现在相同Zn2+条件下，18 ℃时文昌鱼存活率最高，超过这个温度，文昌鱼存活率降低，这说明温度会影响污染物对生物体的毒性作用。Tang等[24]通过研究五溴联苯醚对大型蚤毒性作用也发现SOD和CAT在低浓度的五溴联苯醚的作用下有显著升高现象。Chi等[25]研究了BDE-209对体外培养的人体红细胞(hRBCs)也发现BDE-209会诱导SOD CAT酶活性升高。这可能是由于在低温条件下BDE-209引起肝脏组织的氧化应激反应较小，而在常温和高温条件下BDE-209对鱼体肝脏组织造成了氧化胁迫，使机体产生过多的氧自由基，氧自由基得不到及时有效的清除就会对机体造成氧化损伤，所以在高温时SOD、CAT、GR活性均受到抑制应该是BDE-209已经对肝脏组织造成氧化损伤。张喆等[26]通过研究BDE-209对菲律宾蛤仔外套膜的氧化损伤也发现SOD和CAT在清除BDE-209胁迫产生的氧自由基过程中发挥重要作用，高浓度的BDE-209会抑制抗氧化酶的活性，这与本实验研究结果相似。

3.2 不同温度下BDE-209对草鱼幼鱼脂质氧化产物MDA的影响

MDA是一种脂质氧化的天然产物，MDA的含量可直接反映机体组织内脂质过氧化程度，间接反映组织细胞损伤的程度[27]。在本研究中同一温度下，常温组和高温组随着BDE-209浓度的升高MDA含量显著升高，可见在一定温度范围内温度越高BDE-209对组织细胞的损伤越大，武艳华[28]研究表明汞在高温状态下对草鱼肝脏细胞造成的损伤更大，这与本实验结果相符。这表明高浓度的BDE-209会对组织细胞造成严重的氧化损伤。Wang等[29]在BDE-209对大鼠甲状腺的毒性研究中发现BDE-209会造成大鼠甲状腺的氧化损伤，其MDA含量也有显著升高现象。