泌尿生殖道脲原体喹诺酮类耐药机制的初步研究

程灿灿，朱剑霞，古裕莲，陈顺仪，张金枚

(1.广州市番禺区中心医院检验科，广州 511400； 2.江门市中心医院中山大学附属江门医院产科，广东 江门 529000)

引起泌尿生殖道感染的常见支原体有脲原体、人型支原体以及生殖支原体。脲原体属有Parvo和T960两个生物型，其是两个独立的种。具有Parvo生物群特征的脲原体又被称为微小脲原体(Ureaplasma parvum，Up)，而有T960生物群特征的支原体被称为解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)[1]。在临床工作中，常规支原体培养及药敏检测尚不能区分Uu和Up[2]，本研究收集的脲原体包括这两个种。由于脲原体结构和代谢上的特殊性，导致用于临床治疗的抗菌药物有限，目前主要有喹诺酮类、大环内酯类和四环素类药物。近年来支原体的耐药呈现逐年升高的趋势，其对喹类药物的敏感性显著降低，耐药现象尤为严重[3]。研究显示，喹诺酮耐药决定区域(quinolone resistance determining regions，QRDRs)基因突变与脲原体对该类药物的耐药相关[4]。本研究针对性地检测脲原体gyrA、gyrB、parC、parE基因中QRDRs的突变情况，初步探讨泌尿生殖道脲原体对喹诺酮类的耐药机制。

1 材料与方法

1.1一般材料

1.1.1菌株来源 选择2017年2月在广州市番禺区中心医院就诊的556例泌尿生殖道感染患者为样本来源，患者年龄16～64岁，平均(33±8)岁，无其他严重基础疾病。由接诊医师进行标本采集。男性清洗及消毒尿道口后，用尿道拭子插入患者尿道口2～4 cm处轻旋1周，停留片刻后取出；女性清洗及消毒外阴后，用拭子插入患者宫颈口1～2 cm处轻旋1周，停留片刻后取出。标本无菌密封并立即送检。

1.1.2主要仪器和试剂 Veriti FAST 96-WELL型聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(美国Applied Biosystems公司)；Gel Doc XR+凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；Taq DNA聚合酶(批号：AH0645A)、DNA Marker 2000(批号：A2201C)均购自TaKaRa公司[日本宝生物工程(大连)有限公司]；DNA提取液购自中山大学达安基因股份有限公司(批号：2017001)；支原体培养、鉴定、药物敏感一体化试剂盒购自珠海丽珠生物技术有限公司(批号：2016119809)；引物合成及测序服务均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2实验方法

1.2.1支原体培养及药敏试验 严格按照支原体培养、鉴定、药物敏感一体化试剂盒说明书进行标本的接种、鉴定及药物敏感结果判定。具体操作为：溶解培养小瓶中的培养基后，取50 μL培养基加入C-空白孔中，然后将无菌拭子采集的样本插入培养基中，挤压旋转拭子数次，弃拭子，将混匀的液体培养基分别加入试剂条所有鉴定及药敏孔中(除C-外)。最后在每一孔中滴加一滴无菌液体石蜡并密封。将含有剩余培养基的培养小瓶与试剂条一起置于35 ℃的培养箱中培养，分别于24、48 h后观察鉴定及药敏结果。其中，试剂条喹诺酮类药物的药敏孔为氧氟沙星(4 mg/L和8 mg/L)、左氧氟沙星(2 mg/L和8 mg/L)和司帕沙星(1 mg/L 和4 mg/L)，3种药物分别设置高、低两个浓度，每个浓度设置1孔。在检验结果鉴定为脲原体阳性的标本中，对应药物的两个浓度药敏孔均不变色提示对该药物敏感，对应药物的两个浓度药敏孔均变为红色提示对药物高度耐药，低浓度孔变红色、高浓度孔不变色提示低度耐药。从中筛选出对喹诺类药物低度耐药和高度耐药的脲原体阳性的培养基(菌液)，并于-80 ℃保存备用。

1.2.2脲原体DNA提取 选取7株有代表性的菌株(对至少1种喹诺酮类药物高度耐药)提取DNA并进行基因扩增和测序。取上述保存备用的菌株液体培养物400 μL，12 879×g离心5 min后弃上清，加灭菌的0.9%氯化钠溶液1 mL,充分混匀后12 879×g离心5 min并弃上清液；沉淀物中加入50 μL DNA提取液，充分混匀后100 ℃温浴10 min，冷却后12 879×g离心5 min，取上清液备用。

1.2.3PCR扩增及测序 以提取的脲原体DNA为模板，PCR扩增gyrA、gyrB、parC、parE基因。所涉及的引物序列[5]见表1。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，退火30 s(各片段退火温度见表1)，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并将扩增出的PCR产物送公司进行纯化测序。

表1 引物列表

1.3观察指标 根据鉴定及药敏结果分析脲原体感染和耐药情况。对测序基因进行序列分析，参照已报道的脲原体标准株Up ATCC 27815(GenBank序列号：CP000942)[6]和Uu ATCC 33699(GenBank序列号：CP001184)[7]的gyrA、gyrB、parC、parE基因分析并确定耐药菌株的QRDRs序列的突变情况，并进行氨基酸预测。

2 结 果

2.1引起泌尿生殖道感染的支原体菌株分布及药敏结果 本研究共有556份标本送检，其中支原体阳性标本314例，单纯脲原体感染246例。支原体阳性率达44.2%(246/556)。菌株药敏试验显示，43例对3种喹诺酮类药物均敏感，占17.5%；38例对至少1种药物高度耐药，占15.4%。对氧氟沙星高度耐药的菌株有36例，占14.6%，对司帕沙星敏感的菌株有88例，占35.8%，见表2。

表2 246例单纯脲原体感染病例对喹诺酮类药物的耐药情况

2.27株菌株的PCR扩增结果及分析 PCR扩增7株菌株的gyrA、gyrB、parC、parE基因片段，经电泳检测在250～500 bp有一明亮清晰条带，与目标片段大小一致，见图1。

M：marker 2000；1-7泳道分别为1-7号标本对应的PCR扩增产物

图1 gyrA、gyrB、parC、parE基因片段电泳图

PCR产物经纯化测序，得到的DNA序列与标准菌株(ATCC 27815)相应的基因序列进行比较。结果显示，7株菌株的gyrA和gyrB片段与Up ATCC 27815的相应基因序列相似度为100%，而与Uu ATCC 33699的相应基因序列相似度则较低，7株菌株可能均为Up而非Uu。耐药菌株的parC和parE片段与ATCC 27815的相应基因序列比较，7株耐药菌株的parC均可见C248T突变，parE均可见T1473C突变。见表3。在这些突变点中，只有C248T为非同义突变，造成parC的第83位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸(S83L)，其余突变位点均为同义突变，未导致氨基酸改变。

3 讨 论

因脲原体无细胞壁，所以对作用于微生物细胞壁的抗菌药物如β-内酰胺类、万古霉素等天然抵抗；又由于其生长繁殖过程不合成叶酸，因此对磺胺类及甲氧苄啶也不敏感；此外，对氨基糖苷类、多黏菌素、利福平等也高度耐药。泌尿生殖道支原体感染

表3 7株耐药菌株parC和parE基因的变异情况

治疗首选大环内酯类、喹诺酮类以及四环素类药物。喹诺酮类是一类人工合成的广谱抗生素，对脲原体有较好的抗菌活性，可口服用药，因不良反应少而被广泛应用。本地区之前的研究显示，脲原体对喹诺酮类药物(氧氟沙星、左氧氟沙星和司帕沙星)的全敏感率为12.24%[8]，本研究结果(17.5%)与此接近。脲原体对喹诺酮药物不同程度的耐药在本地区及其他地区已相当严重，因此探讨耐药机制十分必要。

喹诺酮类药物是通过抑制Ⅱ型拓扑异构酶活性(包括旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ)，阻止细菌DNA复制，从而导致细菌不能正常繁殖传代。旋转酶是由gyrA和gyrB基因编码，而拓扑异构酶Ⅳ是由parC和parE编码。这4个基因的突变均可导致酶结构或空间构象的改变，进而导致药物不能与靶酶结合而产生耐药。本研究选取的是对至少1种喹诺酮类药物高度耐药的菌株。这7株菌的旋转酶基因gyrA、garB的保守性较高，在所测序列位置未发现碱基突变。拓扑异构酶Ⅳ基因的突变较多。与标准菌株ATCC 27815序列进行比较，parC基因C248T(S83L)突变模式在7株菌中均存在。有文献报道，C248T是否发生与喹诺酮类药物敏感性密切相关[9-10]。近年来，这一突变在临床分离的耐喹诺酮的Up与Uu中被频繁检出，成为中国地区QRDRs最普遍的突变[7]。S83L在parC上的突变在全球各地频繁出现，欧洲[11]、北美[4]、亚洲等地都有报道。Kawai等[10]采用软件对S83L和S83W进行结构预测分析发现，这两个突变的氨基酸位点均可通过位阻作用干扰菌株与喹诺酮类药物的结合，但在体外实验中并未观察到该突变直接导致脲原体耐药的证据。S83L和S83W形成的耐药性可针对氧氟沙星、左氧氟沙星和司帕沙星3种喹诺酮类药物。虽然该突变与喹诺酮类药物的耐药机制相关，但这7株带有相同耐药突变位点的菌株对这3种喹诺酮类药物的敏感性不完全相同，提示极有可能存在其他的耐药机制。有报道指出，脲原体细胞膜通透性的改变可能是耐氟喹诺酮类机制其中之一[12]。

本研究结果显示，parC、parE基因存在较多的同义突变位点。parC基因的突变G270C、T408C和parE基因的突变T1473C在本研究中也较普遍，但未发生氨基酸突变，可能是基因的多态性位点。对于gyrA基因，最常见的非同义突变是L176F，其次是Up中的 F67I、K78I、G179D、S174R，以及Uu中的 D77V[3]。研究显示，与喹诺酮相关的parC和gyrA突变类型可能存在地区差异[13]。因此，有必要进行大样本耐药基因的调查分析，了解本地区脲原体QRDRs突变特点，以明确本地区脲原体对喹诺酮类药物的耐药机制。

7株临床株经扩增后测序发现，gyrA、gyrB、parC和parE基因与标准菌株的序列比较，提示属于Up的可能较大。目前，Uu和Up的划分主要依据基因组之间的差异，核酸检测能进行区分[14]，但尚未应用于临床诊断。文献报道，Up的检出率明显高于Uu，甚至健康体检人群也携带Up[15]，但截至目前尚不能证明哪一种脲原体的致病性更强。在女性下生殖道标本中脲原体的定植较常见，因此临床工作中Uu及Up的区分也十分必要。但在对喹诺酮药物如氧氟沙星、左氧氟沙星的体外敏感性上，Uu及Up的差异并不大[16-17]，parC基因的C248T突变造成的氨基酸S83L改变在两种脲原体中均有检出，并未发现在哪一种脲原体中独立存在。许多研究致力于脲原体耐药机制的探索，但其耐药机制复杂，目前尚无确定的单一耐药机制。目前认为主要是gyrA、gyrB、parC以及parE基因的突变导致脲原体对氟喹诺酮类药物不敏感[18]，但有报道显示形成生物被膜与喹诺酮类药物敏感性降低有关[19-20]。有专家研究了基于脲原体管家基因(ftsH、rpL22、valS、thrS)的多位点序列分型方案，试图通过研究脲原体的不同克隆群特点分析多位点序列分析与脲原体药物敏感性的关系[21]。

综上所述，喹诺酮类药物对本地区的脲原体存在较低的体外敏感性，并检测到脲原体存在与喹诺酮耐药相关的基因突变，即parC基因C248T(S83L)突变。由于本研究的限制及现有的耐药机制研究并不能完全解释脲原体临床分离株对喹诺酮的耐药机制，因此持续监测解脲脲原体喹诺酮类药物的耐药情况并进一步探讨脲原体喹诺酮耐药机制十分必要。