化学小分子靶标鉴定方法的研究进展

陈杰波，蔡军

(1.上海交通大学医学院，上海200025； 2.上海交通大学医学院病理学系，上海200025)

化学小分子作为药物用于治疗和预防疾病已经非常普遍。小分子药物进入细胞或组织后与相关靶标结合，引起细胞或组织的一系列反应，调节细胞或组织的功能和代谢，从而达到治疗和预防相关疾病的目的。化学小分子靶标的鉴定是生物化学研究的重点。随着以基因组学、蛋白质组学、生物信息技术以及比较分析为基础的研究方法的发展，近年来化学小分子靶标的筛选和鉴定发展迅速。目前所发现的靶标多数为蛋白质，包括激酶、蛋白酶、受体、离子通道等。

靶标发现与确证的一般流程是：首先获取疾病相关生物分子信息，然后研究这些分子的功能以确定药物靶标，最后针对靶标设计化合物进行有效性验证[1]。目前，化学小分子靶标的鉴定在生物医学领域越来越重要，其鉴定方法也多种多样，各具优劣[2]。当前应用的鉴定方法既有独立性，又有互补性，其结合运用可能更加有利于化学小分子靶标的鉴定。现就化学小分子靶标鉴定方法的研究进展进行综述。

1 以基因组学为基础的鉴定方法

基因组学方法主要分析化学小分子对基因组表达水平的影响，获得小分子作用的特征表达谱，通过分析确定分子靶标。但由于基因表达与蛋白质表达之间的对应关系存在一定的不确定性，不能直接确定药物靶标，因此存在一定的局限性。

1.1基因芯片技术 基因芯片技术在DNA测序、基因表达分子与基因调控机制研究、基因药物设计与筛选等方面应用广泛[3]。Sun等[4]从8例乳腺癌患者的癌组织以及癌旁组织中提取RNA，并分离微RNA(microRNA，miRNA)，利用基因芯片技术和双重荧光法，通过分析检测正常组织和癌细胞中miRNAs的差异表达，获得miRNAs乳腺癌表达谱，并进一步确定程序性细胞死亡因子4和程序性细胞死亡因子10分别是miR-21和miR-200c的靶标。郭秋云等[5]对胶质母细胞瘤基因芯片数据进行生物信息学方法分析，从转录水平探讨胶质母细胞瘤与正常组织差异表达基因的功能和相互作用，为进一步研究胶质母细胞瘤的发生发展机制及寻找潜在的药物治疗靶点提供依据。

1.2特征基因及人工构建菌株 基因表达谱存在较多无效信息和干扰信息，通过一定的选取可发掘在相应组织(如肿瘤组织)中特异表达的基因和药物治疗的靶序列。特征基因集合建立后，联合人工构建菌株技术，用这些基因构建相关预测菌株，这些预测菌株的基因表达可直接揭示相关药物的作用机制。近年来，基因组测序技术的发展促进了高通量研究，由于对酵母的生理学特点较为清楚，且酵母具有繁殖周期较短等特点，使酵母迅速成为寻找新药和研究药物作用机制的重要工具[6]。

Hoon等[7]通过结合多拷贝抑制分析(主要基于小分子靶标的过表达会增加对该药物的耐受性这一假设[8])将药物引导的单倍剂量不足分析和纯和性缺失分析置于一个微阵列上。Hoepfner等[9]利用这个方法确定了枝孢菌素的靶标。近年来，分子条形码技术也得到了发展，从以微阵列为基础的分析到下一代测序，使得单倍剂量不足分析和纯和性缺失分析的数据分析更加灵敏、动态范围更大、检测范围更广[10]。

1.3生化抑制策略 在基因组中，由一个基因突变引起的表型改变可被其他基因的过表达消除，该现象是生化抑制策略的基础。生化抑制策略是用化学抑制剂作为“突变基因”，而其他部分纯化的蛋白混合物作为一种“过表达蛋白”，以此研究相关化学抑制剂的作用方式与靶标。Peterson等[11]将该策略应用于鉴定pirl1的靶标发现，过表达的Arp2/3阻止了pirl1的抑制作用以及细胞分裂周期蛋白42的过表达对pirl1无影响，可能是下游产生抑制作用。生化抑制策略虽可用于确定抑制性靶标以及信号通路中的其他化合物，但也有其局限性，仅可应用于可融合可片段化的蛋白质，该方法并不适用于对疏水性蛋白质的研究[12]。

2 以蛋白质组学为基础的鉴定方法

蛋白质组学主要是寻找小分子作用的蛋白质，分离纯化，由此确定小分子的靶标，为其作用方式提供直接证据。

2.1蛋白质差异表达的应用 化学小分子作用前后细胞蛋白质的种类和数量发生了变化，通过对差异表达的检测可以估计小分子的作用方式，筛选出相应靶标。

2.1.1荧光差异二维凝胶电泳技术 相对于普通凝胶电泳，荧光差异二维凝胶电泳技术可在一块聚丙烯凝胶上直接比较两种蛋白质样本，避免了两块凝胶比较时可能产生的系统误差。此外，可以定量分析大量修饰过的蛋白，提供结构和翻译后修饰信息，使重要生物系统变化的鉴定和蛋白功能阐述得以实现；同时可以定量分析截短的或部分降解的蛋白质[13]。但由于疏水蛋白、膜蛋白以及等电点或极端大或小分子量的蛋白质难以保持溶解状态，因而难以用此方法鉴定。此外，荧光差异二维凝胶电泳技术难以区分具有相似分子量和等电点的蛋白质。

2.1.2色谱共洗脱 配体-靶标复合物在高效液相色谱共洗脱加上配体-靶蛋白结合导致化合物色谱滞留时间的特征性转移，从而可用高效色谱液相法-质谱/质谱法来确定靶蛋白[12]。

Chan等[14]用色谱共洗脱鉴定Erg6p(一种甾醇类生物合成酶，是抗真菌试剂的靶蛋白)，同时鉴定了多巴胺受体激动剂(A77636)的脱靶蛋白。运用色谱法后，实验虽然免去了对化合物或蛋白质进行固定或标记，但是由于实验需要分离未结合和结合的化合物，导致共价结合物被排除在外。此外，实验中需要溶解较多的靶蛋白，使药物和靶蛋白的反应受到限制。

2.2蛋白质亲和特性的应用 亲和纯化是利用生物分子间的特异性结合进行蛋白质的分离和纯化。目前的亲和纯化技术主要有亲和层析技术、串联亲和纯化法、细胞培养稳定同位素标记法、小分子探针以及蛋白质芯片技术等。

利用蛋白质亲和特性研究药物与靶蛋白的结合，需要对药物分子进行构效关系研究，但无需了解药物与靶蛋白之间可能发生的某些特定的细胞或生化反应，研究可能受药物小分子衍生产物的限制[15]。此外，合适的作为阴性对照的化学小分子药物也较难得到。

2.2.1细胞培养稳定同位素标记法 细胞培养稳定同位素标记法是在细胞培养过程中利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术对蛋白的表达进行定量分析的一种体内代谢标记技术。目前标记的氨基酸的种类已扩展到亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸以及酪氨酸等[16]。作为体内代谢标记技术，其标记效率高,不需要对样品进行预处理，具有高通量性，且样本需求量少、操作简单、定量精确，适用于大分子量、复杂生物样品的分析，可以鉴定出更多低丰度蛋白，包括细胞表面蛋白、细胞器特异性蛋白、磷酸化蛋白或糖蛋白等经翻译后修饰的蛋白。此方法也具有一定的局限性：①实验中需要将单个蛋白分离纯化，导致误差较大[17]；②不相关的共洗脱的离子发生同位素聚集，使定量分析复杂化；③为了保证同位素标记的氨基酸混合的完整性，限制使用处于高水平复制的细胞；④不能使用人体或其他组织样本。

2.2.2小分子探针 小分子探针主要由报告基团、连接基团以及活性基团组成，作用原理是小分子活性基团部分与靶标紧密结合，而报告基团部分可有效标记靶标生物大分子，之后可通过亲和层析、凝胶电泳和质谱分析等手段确认靶标蛋白。传统探针要求探针分子与靶蛋白不可逆结合，但由于报告基团体积较大，有可能阻碍细胞对探针的吸收，影响探针的分布及其亲和力，故出现了不带报告基团的bio-orthogonal探针，先用不带报告基团的探针与靶标蛋白共价结合，再通过bio-orthogonal反应将被标记的蛋白与报告蛋白连接，避免因报告基团(生物素、荧光基团等)体积过大而影响探针分子在细胞内的分布以及对靶标的亲和力，方便在活细胞内的研究。

小分子探针确定靶标具有一定的局限性：①细胞内丰度低或与探针结合力弱的蛋白难以鉴定；②探针与杂蛋白非特异性结合具有一定的干扰作用，采用高强度洗脱和阴性对照可消除一定的影响；③需要对化合物进行构效分析，且合成的探针分子应保持原有的生物活性和作用机制，所以工作量大且需要丰富的医药化学专业知识；④为了将化合物与连接链和报告基团连接,通常还需要在化合物母核上引入氨基、羟基、羧基等官能团,这些基团的引入可能对化合物的活性产生影响[15]。

2.2.3蛋白质芯片技术 蛋白质芯片技术是将一个蛋白质库以二维可设定位置的网格格式固定在一个载玻片或芯片上，可测定亲和力低和含量低的蛋白质。由于蛋白会变性，因此在蛋白质芯片的制造过程中要保证蛋白的构象和功能，并且要表达和纯化大量正确折叠且有活性的蛋白，蛋白质芯片耗时长，实验要求高，制造难度远远高于基因芯片。根据实验样品的添加顺序，蛋白质芯片技可分为正相芯片技术和反相芯片技术。正相芯片技术具有高特异性，但十分耗时，且需要大量的蛋白质探针[18]；反相芯片减少了检测蛋白质抗原所需的抗体探针的量，但对于相对低浓度样本中靶蛋白的敏感性降低[19]。

近来一些新的蛋白质微阵列技术如巨磁阻检测芯片技术(灵敏度高，巨大磁抗性传感器定量分析并用磁纳米微粒标记)，蛋白直接由微阵列上的核酸进行表达的核酸可控蛋白芯片技术(庞大的蛋白库)[19]等也逐步被应用。

2.3蛋白质稳定性的应用 基于靶蛋白与小分子结合后稳定性变化，包括抗酶解活性、热稳定性等，发展出了一系列小分子靶标的筛选鉴定方法。

2.3.1蛋白质抗酶解活性 小分子化合物的结合可能会掩盖蛋白酶的剪切位点或结合小分子后的靶蛋白局部或整体构象的稳定性增加，对蛋白酶的易感性下降，导致结合小分子的靶蛋白可能较未结合状态的靶蛋白不易被蛋白酶降解[12]。基于这个原理，发展出药物亲和反应靶标稳定性(drug affinity responsive target stability，DARTS)研究方法。细胞裂解液与小分子化合物混合[20]，裂解液中蛋白质被嗜热菌蛋白酶和链霉蛋白酶裂解，通过免疫印迹法分离出因为与小分子结合而未被裂解的蛋白质，最后进行质谱分析，确定靶蛋白[21]。

相对于亲和色谱分析法，DARTS实验中小分子化合物不需要经过构效分析或对配体进行化学修饰[20]。Lomenick等[15]提出，未来可以联合使用DARTS与多向蛋白质鉴定技术，进一步增加实验检出靶蛋白的灵敏度。

2.3.2氧化速率的蛋白稳定性(stability of proteins from rates of oxidation,SPROX) SPROX与DARTS类似，DARTS利用的是蛋白质不同的水解特性，而SPROX利用的是不同的折叠状态和热力学稳定性。小分子化合物与靶蛋白结合后可能对靶蛋白的折叠状态以及热动力学稳定性产生影响而使靶蛋白发生变化[22]。一定时间和一定浓度的化学变性剂存在时，蛋白质的甲硫氨酸残基只发生部分氧化，不同折叠状态的蛋白质氧化程度不同，即可以通过氧化速率反映蛋白质的不同折叠状态。

SPROX具有一定的局限性：①只能准确检测样本中含量较高的蛋白质靶标。②只有含有甲硫氨酸的蛋白质才适用这个方法，即使含有甲硫氨酸，也并非所有的甲硫氨酸残基都会展现出不同的氧化速率足够用来确定热动力学稳定性的改变[15]。

2.3.3蛋白质热稳定性 Martinez Molina等[23]将临床药物作用于细胞裂解液中4个不同的靶蛋白时发现，所有的靶蛋白都有其独特的熔解曲线，当已知可结合到这些蛋白上的药物加入细胞裂解液中，可以观测到明显的熔解曲线移动，根据这一原理开发出细胞热转移(cellular thermal shift assay，CETSA)方法，其可以直接测量药物到达靶细胞的程度，检测小分子在细胞裂解液甚至完整细胞组织中的作用。

CETSA适用范围广，可在细胞水平和动物水平直接测量药物分子是否到达作用靶点，验证了重要的临床药物靶标。根据药物在体内和体外与靶标结合时间、结合程度的差异，可进一步研究小分子药物在体内转运激活的过程。Savitski等[24]通过对人K562细胞进行热力学蛋白质组分析，观察到完整细胞和细胞裂解液的熔解特性存在差异，用抑制剂十字孢碱和GSK3182571验证了蛋白质组分析的可行性。同时确定了亚铁血红蛋白生物合成酶亚铁螯合酶是多种激酶抑制剂的脱靶蛋白，进一步解释了原卟啉症患者畏光的可能原因。此外，采用此方法研究发现，药物达沙替尼导致了慢性髓系白血病BCR-ABL信号通路下游蛋白的热转移[24]。

CETSA也有局限性。CETSA的蛋白熔解曲线是基于靶蛋白与小分子结合后热稳定性增强这一特性建立起来的，而大的蛋白质包括蛋白质复合物有可能没有这种小分子引起的反应或者反应微弱。此外，加热可能会导致小分子与血浆蛋白结合和细胞通透性改变等，所以应尽可能地缩短加热时间，减少样本量或彻底改变样本几何学特性以及加热装置以改善热传递。另外，若小分子参与细胞快速反应信号通路，则有可能影响蛋白的翻译后修饰，所以细胞与小分子化合物的预先孵育时间会影响抗体对靶蛋白的检测能力[25]。一些蛋白质的配体结合位点的结构域未折叠，也无法通过CETSA进行靶标鉴定[22]。

3 基于克隆扩增的鉴定方法

3.1三杂交系统 目前主要有两种三杂交系统：酵母三杂交系统和哺乳动物三杂交系统，前者是在酵母中进行，后者是在哺乳动物中进行[26]。在三杂交系统中，DNA结合域与转录激活域的相互作用是通过小分子化合物的桥联完成的，互补DNA编码的靶蛋白可直接通过这种方法进行分离鉴定。但未正确折叠和转录后修饰的靶蛋白、膜结合蛋白和部分蛋白质复合物无法鉴定，并且杂交的配体必须能够进入酵母细胞并保持活性。

3.2显示技术 显示技术包括噬菌体显示法和mRNA显示法等。噬菌体由于对其配体的特异亲和性而不断得到富集，因此噬菌体显示法可检测微弱表达的蛋白，并能确定其亚结构域与结合的关系。但有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运等，导致无法在噬菌体中获得表达，限制了噬菌体显示法的应用。

mRNA显示法是将mRNA与其编码的多肽用嘌呤霉素连接融合，该融合物被纯化，经过逆转录得到cDNA以进一步扩增、表达，之后与固定于固相载体上的小分子共同孵育以鉴定。但在表达、克隆及显示的过程中产生的多肽大多具有毒性，因此mRNA显示法同样存在局限性。

4 其他鉴定方法

4.1比较分析研究的鉴定方法 随着用小分子处理细胞得到的可用数据逐渐增多，化合物的特有“指纹”如基因表达、蛋白组谱、表型的多参数分析、细胞毒性数据的收集成为可能，由此形成的数据库可通过相似性比较，识别当前小分子的靶标，其是目前最有效的识别药物靶点的方法之一[12]。

4.2副作用报告系统的鉴定方法 化学小分子靶标的鉴定不仅可用于阐明相关化合物的作用方式，也可用来识别所谓的“脱靶”蛋白，即化学小分子作用的靶标以外的蛋白。药物小分子与“脱靶”蛋白结合，产生不良反应甚至生物毒性。Takarabe等[27]利用副作用报告系统定义了所有药品的药理学相似性，同时运用靶蛋白基因组序列的相似性发明了一种可以在大范围预测未知药物——靶标反应的方法，特别是针对那些无法预知药物化学结构的未知反应，并对1 874种有已知靶标的药物的“脱靶”蛋白以及2 519种靶标未知的药物的可能靶标进行了综合性预测。

5 小 结

化学小分子靶标的鉴定方法在药物研发和化学小分子作用机制的研究中发挥重要作用。相对于根据可能的靶标对下游物质产生效应进行推测的方法，直接鉴定更加准确。新近的研究技术，包括高通量的扫描[28]、高灵敏度的质谱分析[29]、化学探针、正电子发射断层成像技术、体内生物荧光成像技术[30]等的发展促进了靶蛋白的分离和鉴定。

目前一种药物作用于多种蛋白的概念已被逐渐接受，药物的研发和合成并不只是针对致病基因和蛋白，而是研究整个药物作用和致病作用的网络。这对化学小分子靶标的鉴定提出了更高的要求。随着基因组学、蛋白质组学、生物信息学、遗传学及生物技术等学科的持续发展，现有方法还会不断完善，新方法、新策略将不断涌现，届时可发掘出更多药物新靶标，明确相关靶标的作用机制，进而更好地研制高效药物。