调心安神针法预处理对缺血再灌注性心律失常兔心肌细胞凋亡的影响*

王 锐，郭 丽，崔华峰，李永春，王长春，李明妍，徐 敏

(1.山东中医药大学附属医院，山东 济南250011；2.山东中医药大学,山东 济南 250355)

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是一种常见的临床现象，可引起心肌组织结构、功能异常、大量细胞凋亡甚至心律失常的发生[1]，尤其是室性心律失常。据报道，心梗后溶栓或支架植入后，室性心律失常发生率可达80%[2]，是再灌注后猝死的主要原因。笔者基于多年临床经验，以灵台、神道、内关、百会穴组成调心安神方，并施行特定的操作手法，治疗早搏取得较好的疗效[3]。前期研究发现，该针法可减少室性心律失常模型兔心肌细胞损伤，明显缩短室性心律失常持续时间[4]。在此基础上，笔者采用结扎/松解兔左冠状动脉前降支的方法制作RA模型兔，观察调心安神针法预处理对RA模型兔心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

健康家兔40只，雌雄各半，体质量1.5～2.0 kg，济南西岭角生物科技有限公司提供[动物合格证号：SCXK(鲁)20150001]。免疫组化一抗：兔抗Bcl-2和兔抗Bax(proteintech公司，货号分别为12789-1-AP、50599-2-Ig)；广谱二抗(上海长岛生物技术有限公司，货号D-3004);RIPA组织细胞快速裂解液(上海基尔顿生物科技有限公司，货号BYL40825)；BCA蛋白定量试剂盒(thermo公司，货号PICPI23223);Western印迹法检测一抗：活性Caspase-3抗体(Abcam公司，货号Ab2302)；GAPDH抗体(CST公司，货号#5174)；羊抗兔HRP标记二抗(碧云天生物技术有限公司，货号A0208)。

1.2 分组及建模

40只家兔随机分为假手术组、模型组、针刺组、胺碘酮组，每组10只。

再灌注性心律失常模型复制参照Reffelmann的方法。兔耳缘静脉注射20%乌拉坦(4 mL/kg)麻醉，呼吸机导管连接气管插管给予机械通气，呼吸频率30 r/min，吸呼比1∶1.5，通气流量根据肺膨胀大小调整。开胸，左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿线、结扎，立即监测心电图Ⅱ导联T波、ST段变化，以左室前壁发绀及心电图ST段抬高≥0.5 mV为缺血标志。结扎40 min后松开硅胶管，恢复灌流60 min，抬高的ST段相对降低(>50%)，缺血区域心外膜颜色恢复红润。连续记录心电图至手术完毕，取缺血区中央部位心内膜心肌。

假手术组：穿线不结扎，静置100 min。针刺组：造模7天前开始给予调心安神针法预治疗，每天1次，共7天。针刺组和模型组第8天造模取材。胺碘酮组：于再灌注即刻泵入胺碘酮(3 mg/kg溶于生理盐水5 mL中)，5 min泵入完毕。

1.3 针刺方法

参照中国针灸学会实验针灸专业委员会制订的“动物针灸穴位图谱”取穴。灵台、神道均向上斜刺5 mm，用震颤法快速小幅度行针1 min后起针；百会穴向后平刺5 mm；双侧内关穴分别直刺5 mm，行针1 min后接电针治疗仪，疏密波，刺激强度以家兔上肢出现轻微颤动为度。百会、内关留针20 min。

1.4 观察指标

1.4.1 Bcl-2、Bax蛋白检测 将采集的心肌组织立即置于液氮停留约30 s使组织立即降温、冻结，装入自封袋中保存于-80℃冰箱。切片前将组织样本置于-20℃冰箱内复温30 min，用OTC包埋胶包埋组织，置于冷冻切片机上，冻结后切片，切片厚度5～7 μm，1张用于HE 染色，2张用于免疫组化染色。于光学显微镜下400倍放大拍照, 显微图像分析系统分析阳性表达面积。

1.4.2 活性Caspase-3检测 将心肌组织剪成细小的碎片，加入裂解液，匀浆器匀浆直至完全裂解，4℃ 12 000 g离心15 min，取上清进行蛋白质定量，并据此进行PAGE胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，稀释一抗抗体(活性Caspase-3 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000)，和膜室温孵育2 h。TBST洗涤3次，1∶1 000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL发光液显色，以Tanon-5200成像系统进行扫描分析。以GAPDH作为内参。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色

假手术组：心肌组织结构正常，无异常形态学改变;模型组：心肌组织可见明显损伤，细胞排列紊乱、连接疏松。针刺组与胺碘酮组：心肌损伤较轻，部分心肌排列紊乱,细胞间轻度疏松溶解,可见较多炎性细胞聚集；炎性细胞明显减少。见图1。

图1 各组HE染色

2.2 Bcl-2、Bax蛋白表达比较

结果显示，模型组Bcl-2蛋白表达最低，假手术组最高，针刺组、胺碘酮组均较模型组明显升高(P<0.01)，针刺组较胺碘酮组低(P<0.05)；模型组Bax蛋白表达最高，假手术组最低，针刺组、胺碘酮组均较模型组明显降低(P<0.01)，针刺组与胺碘酮组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、封三彩图2～3。

表1 各组Bcl-2、Bax蛋白阳性表达面积比较

注：与模型组比较，△P<0.01；与假手术组比较，☆P<0.01；与胺碘酮组比较，※P<0.05，◎P>0.05。

2.3 活性Caspase-3表达比较

结果表明，模型组活性Caspase-3表达最高，假手术组最低，针刺组、胺碘酮组均较模型组明显降低(P<0.01)，胺碘酮组较针刺组低(P<0.01)。见表2、图4。

表2 各组活性Caspase-3表达比较

注：与模型组比较，△P<0.01；与假手术组比较，☆P<0.01；与胺碘酮组比较，※P<0.01。

图4 各组活性Caspase-3表达比较

3 讨论

RA是缺血心肌再灌注后引起的损伤，与氧自由基、细胞间耦联、钙离子、自主神经及体液系统等多种因素相关[5]。在心肌缺血再灌注损伤的发生过程中，细胞凋亡对心肌细胞的结构与功能损害起着非常重要的作用。因此，抑制心肌细胞凋亡的干预因素，能够减轻心肌缺血再灌注损伤[6]。

MIRI中细胞发生凋亡的机制主要包括氧化损伤、影响线粒体功能和能量代谢、钙稳态失衡等[7]，Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白酶家族在线粒体途径中起着关键作用。其中，Bcl-2 是重要的细胞凋亡抑制因子，Bax是重要的细胞凋亡促进因子，二者相互作用调控细胞凋亡过程，通过改变线粒体膜的通透性和调控细胞色素C的释放，激活下游的半胱氨酸蛋白酶家族而诱导凋亡[8]。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要效应因子，能灭活诸多修复程序及抑制凋亡因子，是细胞凋亡级联反应的最后执行者。有研究证实,急性心梗患者血清Caspase-3较健康人群显著升高，对于AMI患者的诊断和预后有一定的临床价值[9]。

免疫组化染色Bcl-2 和 Bax的阳性表达在细胞浆胞内见为棕黄色区域。本研究中假手术组心肌细胞Bcl-2蛋白表达较多，而Bax和Caspase-3蛋白表达较少。RA发生后Bcl-2蛋白表达明显减少，而Bax、Caspase-3蛋白表达明显增加，进一步证实了细胞凋亡参与缺血再灌注损伤过程。

胺碘酮为一种常用的高效抗心律失常药物，可降低窦房结、浦肯野纤维的自律性和传导性，有拮抗兔缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用[10]。本研究显示，调心安神针法预处理和胺碘酮干预后，RA模型兔心肌细胞Bcl-2蛋白表达增加，Bax 、Caspase-3蛋白表达减少，表明二者对于心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用，且胺碘酮作用较调心安神针法更为显著。

灵台、神道穴均属督脉，分别位于第6、5胸椎棘突下。《会元针灸学》曰：“灵台者,……其两旁为督脉之所系，阳气通其中，心灵居上，故名灵台。”《经穴释义汇解》中记载：“……为心气之通道，主心疾，故名神道。”且督脉有一条分支入心中，故位于上焦处的灵台、神道穴可以治疗心脏疾患。现代研究表明，背俞穴的分布规律与脊神经节段性分布特点大致吻合。督脉穴、夹脊穴、背俞穴均位于背俞功能带上，受相同神经支配的各穴治疗作用及作用机制大体相同[11]。认为灵台、神道穴对于早搏有相对特异性的治疗作用[3]，在调心安神针法中要求两穴的操作须力求使针感向前胸或侧胸部放散，即“气至病所”。这种操作作用于躯体感觉神经末梢及交感神经末梢，通过神经的轴突反射、节段反射途径作用于脊髓相应节段的植物神经中枢，以调整心脏功能[11]。内关属手厥阴心包经，为八脉交会穴之一，通于阴维脉，有宁心安神、镇静定痛、理气和胃的作用，四总穴歌有“心胸内关谋”之说。研究表明，针刺内关可增加心肌组织灌流量，改善末梢循环，纠正由于心肌缺血而诱发的心律失常[12]，减少了后除极电位和心律不齐的发生率[13]。而且，针刺内关穴可促进氧自由基清除[14]、减少细胞内Ca2+超载[15]、调节细胞自噬[16]、诱导保护性蛋白[17]等，从而达到对心肌细胞的保护。百会为“五脏六腑奇经之阳，百脉之所会”，具升阳举陷、益气补虚之力，可交通阴阳、调节全身气机[18]。《针灸大成》载百会穴：“主头风中风……心烦闷，惊悸健忘，忘前失后，心神恍惚，无心力……百病皆治。”“人身有四穴最应急……百会盖其一也”，百会还是内科急救常用穴之一。

综上所述，调心安神针法通过上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax 、Caspase-3蛋白表达，抑制心肌细胞凋亡，从而减轻缺血再灌注过程对心肌的损害，与以往的研究是一致的[19-20]，但具体机制还需进一步深入研究。