“标本配穴”电针对慢性心肌缺血模型大鼠线粒体结构及呼吸酶活性的影响*

严江天，陈 茜，李 丹，马劼旎，谢 俊，吴 松,2△

(1.湖北中医药大学,湖北 武汉 430061; 2.针灸治未病湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430061)

心肌缺血指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。随着人民生活水平的提高和我国人口不断老年化，心肌缺血在我国的患病率呈逐年上升的趋势，因此，防治心肌缺血已成为医学研究的重点和热点之一。心肌缺血的发病机制目前还未有定论，但多数研究人员认为自由基生成增加、Ca2+超载、细胞凋亡、中性粒细胞浸润等均参与其发生，而这些环节均与心肌线粒体结构功能障碍有关[1]。线粒体是为机体提供所需的能量ATP的重要细胞器，当心肌组织发生缺血缺氧损伤时，会影响线粒体的功能，甚至破坏线粒体的结构[2]。本实验在前期实验的基础上[2-4]，以大鼠线粒体为切入点，观察标本配穴电针对慢性心肌缺血大鼠心肌3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehy de-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、柠檬酸合酶(Citrate synthase，CS)、细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase，CCO)酶活性及线粒体结构变化的影响，并探讨其治疗慢性心肌缺血的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

本实验选用3月龄、体质量为180～220 g的SPF级Wistar雄性健康大鼠30只，购于湖北省医学科学研究实验动物中心，许可证号：SCXK(鄂)2008-0005。依照随机数字表将大鼠随机分入3组：空白组、模型组、标本配穴组，每组10只。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 752型分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；Finesse 325旋转石蜡切片机(美国赛默飞世尔科技有限公司)；AWL-1001-M艾科浦超纯水机(美国艾科浦国际有限公司)。

1.2.2 试剂 ATP含量测试盒(南京建成生物工程研究所);3-磷酸甘油醛脱氢酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);柠檬酸合酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);线粒体呼吸链复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶)活性测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);盐酸异丙肾上腺素(Isoprenaline Hydrochloride，ISO)(Sigma-Aldrich Co. LLC)。

1.3 模型建立与处置方法

参考文献[5-6]制备实验大鼠心肌缺血模型，适应喂养3天后，于实验大鼠背部皮下注射ISO(5 mL/kg)，连续7日，以心电图S-T段抬高振幅≥0.1 mV视为造模成功[7-8]。适应性喂养3天后，空白组：连续7天行皮下注射0.9%氯化钠溶液(5 mL/kg)；模型组：连续7天行皮下注射ISO；标本配穴组：连续7天在进行电针干预后注射ISO，7日后每日给予电针干预，连续21天。标本配穴组电针参照《大鼠穴位图谱的研制》[9]取双侧“足三里”、双侧“关元”及双侧“内关”“足三里”直刺深约5 mm，“内关”直刺深约5 mm，“关元”直刺深约3 mm。接HANS-200电针治疗仪，同侧“足三里”“内关”组成一对接通电极，共配成2组电极。选用疏密波，频率2～100 Hz，电流强度1 mA，每日1次，1次10 min。

1.4 观察指标

1.4.1 心肌超微结构 各组大鼠于实验第25天，以10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，开胸摘取心脏，用4℃冷生理盐水迅速冲洗心脏组织。横断面切取心脏中下1/4组织，置于2.5%的戊二醛溶液固定，丙酮梯度脱水,包埋，聚合，切片，将制备好的样品放入透射电镜观察检查，釆集图像。

1.4.2 心肌组织ATP含量、GAPDH、CS和心肌线粒体CCO活性测定 各组大鼠于实验第25天，以10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，开胸摘取心脏,用4℃冷生理盐水迅速冲洗心脏组织，称取、匀浆、离心后按照试剂盒说明书步骤操作检测心肌组织中ATP的含量、心肌线粒体CCO活性、心肌组织中CS及GAPDH活性。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 心肌超微结构

由图1可知,空白组大鼠心肌细胞心肌纤维排列整齐，线粒体比较丰富且结构完整，嵴结构有序，边界较清，形态大小一致。模型组心肌损伤严重，心肌细胞排列松散混乱，部分线粒体膜破裂、膜结构消失；线粒体数量减少，明显肿胀，嵴结构模糊、排列紊乱、数量变少，部分线粒体出现嵴断裂，甚至空泡化。标本配穴组损伤程度较模型组明显改善，大部分心肌纤维排列基本整齐，横纹清晰，线粒体结构基本完整，部分线粒体轻微水肿，空泡化减少。

2.2 心肌组织ATP含量、GAPDH、CS和心肌线粒体CCO活性比较

与空白组比较，模型组、标本配穴组心肌组织ATP含量、心肌组织GAPDH、心肌组织CS和心肌线粒体CCO活性均明显降低(P<0.01)。但与模型组比较，标本配穴组4项指标均显著增高(P<0.01)。见表1。

图1 各组大鼠心肌线粒体超微结构(15 000×)

表1 各组大鼠心肌组织ATP含量、GAPDH、CS和心肌线粒体CCO活性比较

注：与空白组比较,#P<0.01；与模型组相比较,△P<0.01。

2.3 心肌组织ATP含量、GAPDH、CS和心肌线粒体CCO活性相关与回归分析

经直线相关回归分析，心肌组织GAPDH活性与心肌组织ATP含量呈正相关(r=0.942，P<0.01)，心肌组织CS活性与心肌组织ATP含量呈正相关(r=0.908，P<0.01)，心肌线粒体CCO活性与心肌组织ATP含量呈正相关(r=0.949，P<0.01)。见图2～4。

图2 ATP-GAPDH散点图

图3 ATP-CS散点图

图4 ATP-CCO散点图

3 讨论

线粒体是细胞生命活动过程中极为重要的细胞器，是细胞有氧呼吸和合成ATP的主要场所。细胞生命活动所需能量的95%均来自线粒体，因此被称为细胞生命活动的“供能中心”。生理活动旺盛的细胞内线粒体含量较生理活动不旺盛的细胞更丰富。心脏作为维持人体正常生命的重要器官，对能量的需求非常大，因此心肌细胞中线粒体的含量也较其他组织丰富，研究表明线粒体占心肌细胞总体积的40%～45%[3]。当心肌细胞处于缺血状态时，线粒体功能受到影响，形态结构同时被破坏[10]。同时，心肌细胞有氧呼吸产生的ATP为心脏提供正常生命活动所需的能量，以维持心肌细胞的舒缩功能和离子泵功能。有氧呼吸的过程主要分为3个阶段：糖酵解、三羧酸循环与氧化磷酸化，而GAPDH、CS、CCO分别是这3个阶段的关键酶，与细胞正常进行有氧呼吸并产生能量有着密不可分的关系。GAPDH作为糖酵解途径中的1个关键酶，参与催化糖酵解的中枢环节，主要催化3-磷酸甘油醛氧化磷酸化为甘油酸-1,3-二磷酸[11]，葡萄糖在其作用下分解并产生为机体提供能量部分的ATP，且具有参与细胞自噬的作用[12-13]；CS催化三羧酸循环(TCA cycle)的第一个反应，被认为是TCA循环的限速酶[14]，催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成柠檬酸和辅酶A[15]，因此其活性影响线粒体整个氧化代谢的过程；位于电子传递链尾端的CCO作为呼吸链中的关键氧化酶，其活性是线粒体能量代谢障碍的内源性指标，能反映线粒体内膜呼吸链功能的完整性和心肌细胞代谢的兴衰[16-18]，并调控能量的代谢。因此心肌组织GADPH、CS、CCO的活性可以反映心肌细胞组织结构完整程度和有氧呼吸的功能强弱，从而推断心脏能量的供给和反映心脏功能的盛衰。本实验通过观察心肌线粒体结构及GAPDH、CS、CCO活性的变化，可以更直观的反映出各组大鼠心肌线粒体的变化，分析心肌线粒体的受损程度，从而观察标本配穴电针干预对心肌线粒体缺血后的保护作用。

本实验采用“以中医治未病为指导思想，双固一通为核心”的标本配穴法，以固护正气的腧穴为本，以祛除邪气的腧穴为标，两者配合应用的腧穴配伍。标本配穴法既能鼓舞机体正气，又能提高机体抵御病邪的能力；既能够针对病邪对病变组织进行局部治疗，又能巩固正气对机体整体进行调节；既体现了“治未病”思想，又将局部效应与整体效应完美结合。本实验选取补益先天之精的关元与固护后天之气的足三里，配以活血通络、宁心安神的内关，关元可培肾固本、补益精血、调理冲任，扶助人体先天之本；足三里为三焦之气所生处，为补益元气、调和气血、补虚强壮之要穴；内关穴为手厥阴心包经的络穴，自古以来是防治心胸部疾患的有效之穴，研究表明，针刺内关穴能通过多个通路、靶点对心脏起到保护及修复作用[19-20]。三穴同用，固本祛邪、标本兼治，起到保护心脏功能的作用，防止病情恶化，促进患者康复。

本研究结果显示，与正常组相比，模型组大鼠心肌线粒体结构遭到严重破坏，心肌组织ATP含量、心肌组织GAPDH、心肌组织CS和心肌线粒体CCO活性均明显降低。与模型组相比，标本配穴组线粒体结构基本完整，较模型组损伤明显降低，心肌组织ATP含量、心肌组织GAPDH、心肌组织CS和心肌线粒体CCO活性也较模型组显著升高。研究说明，标本配穴电针可提升线粒体呼吸酶活性，增加有氧呼吸产能效率，改善心脏能量代谢，从而减轻心肌细胞的结构破坏，对心肌组织起到保护作用，为临床上治疗心肌缺血提供新的配穴思路。