文冠果优良无性系授粉组合选择及结实性状分析

牛 媛，敖 妍，李 云，田秀铭，杨长文，刘小天，李志虹

（1.北京林业大学 省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京100083；2.北京林业大学 国家能源非粮生物质原料研发中心，北京 100083；3.国家林业和草原局调查规划设计院，北京 100714；4.朝阳市果树技术推广站，辽宁 朝阳 122000；5.辽宁文冠实业开发有限公司，辽宁 朝阳 122000；6.科右前旗农牧和科技局农业研究所，内蒙古 兴安盟137713）

文冠果Xanthoceras sorbifolium为无患子科Sapindaceae文冠果属Xanthoceras植物，是少数适合中国北方地区重点发展的生物质能源树种，具有抗寒、抗旱能力强，结实早的特性。文冠果种仁含油率高达67%，可用于生产生物柴油及高级润滑油等工业用油；籽油富含不饱和脂肪酸，可用于生产高级食用油。油粕可做高级饲料，种仁可制作果汁露，其中的药用成分可用于治疗心血管病、遗尿症等疾病；果壳可生产活性炭、糠醛、皂苷等[1-5]。文冠果种实开发利用前景广阔，且其嫁接苗第2年、播种苗第3年即可结实。一定年限内，种子产量随树龄增长递增，8～10 a进入盛果期，结果期可达百年，具有见效快、附加值高、经济效益明显的特点。但是，目前低产仍是文冠果种实开发利用产业发展的主要限制因素，其原因除了缺乏集约的栽培管理措施外，还与文冠果雌雄比例低、自交不亲和等生物学特性有很大关系[6-8]。多数自交不亲和树种如薄壳山核桃Carya illinoensis、杏Armeniaca vulgaris、梨 Pyrus spp.等，利用不同品种花粉控制授粉，分析杂交组合坐果率、果实品质，确定最佳授粉树，提高产量[9-11]。文冠果栽培授粉树配置的重要性还未引起重视，一方面影响文冠果坐果率和种实产量的提高；另一方面，在无性系化推广时[12-13]会出现 “优树不优”现象，影响文冠果优良性状的表现。科学的授粉树配置除要考虑授粉树与主栽品种花期相遇时间长短、亲和性强弱之外，也应兼顾授粉后种实产量及果实品质。本研究以文冠果5个优良无性系为试材，确定其花期物候和最佳授粉时期，通过设计交互授粉、混合授粉、自然授粉，综合分析各授粉组合坐果情况、种实产量及种实性状，得到各无性系的最佳授粉组合，为文冠果优质丰产栽培及优良种质无性系化推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验材料

试验地位于辽宁省朝阳市大平房镇原家洼村文冠果基地（41°25′N，120°16′E），属北温带大陆性季风气候，年均日照2 861.7 h，年均气温为8.4℃，无霜期为158.0 d，年均降水量为489.0 mm。土壤类型为褐土，土层厚度100 cm左右。供试材料是2016年7月嫁接的生长健壮、无病虫害的10号、14号、15号、16号、119号优良文冠果无性系各56株。接穗采自辽宁省朝阳市文冠果基地的15年生实生苗，砧木为1年生干2年根的文冠果实生苗。试验用嫁接苗平均树高107.3 cm，平均地径2.6 cm，株行距1.5 m×1.5 m，常规管理。

1.2 试验方法

1.2.1 花期物候观测 各无性系随机选取10株作为花期物候观测样株。各样株树体东、南、西、北4个方向选取标准枝编号标记，于2018年4月24日至5月15日，每天8：00和16：00观测标准枝上开花数量，并统计开花数量占整个花序总花数量的百分比，10株样株中有一半以上植株达到某物候相标准时，记录该物候开始日期。物候相标准：25%～50%的花开放为初花期；50%～75%的花开放为盛花期；75%～95%的花开放为末花期[14-15]。

1.2.2 柱头可授性检测 各无性系另选10株作为柱头可授性和花粉活力检测取样植株。于盛花期分别采集花蕾初开放（图1A①）、开花当天（花蕾完全开放，图1A②）、花后1～5 d的雌能花（图1A③～⑦），每无性系每时期取20朵，用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性[16]。

1.2.3 花粉活力检测 开花前1 d在取样植株上标记即将开放的雄能花，每天9：00分别采集处于花蕾初开放（图1B①）、开花当天（花蕾完全开放，图1B②）、花后1 d（图1B③）3个阶段的雄能花。每无性系每时期取20朵，采用固体培养基法（质量分数分别为0.50%、10.00%和0.03%的琼脂、蔗糖和硼酸）检测花粉活力[17]。

图1 文冠果开花不同时期雌能花和雄能花Figure 1 Female and male flowers in different flowering stages of X.sorbifolium

1.2.4 授粉试验 各无性系另选36株作为授粉试材，设计交互授粉、混合授粉和自然授粉，其中混合授粉所授花粉为5个无性系混合花粉（mixed pollination,MP），自然授粉组（ck）为对照。因文冠果成熟果实均来自异花授粉[7-8]，故不设计自交授粉。授粉配置设计见表1。每个授粉组合每重复授粉100朵雌能花，3次重复。因文冠果雌能花花药不开裂，故不去除雌能花雄蕊，在开花前1 d识别、去除将要授粉花序上的雄能花和已经开放的雌能花，套袋即可。授粉时，采集正在散粉的雄能花，除去花瓣，用花药涂抹开花当天的雌能花柱头，直到可以明显看到柱头上黄色的花粉为止，之后套袋。授粉后15 d（5月23日），第1次生理落果期结束，结果枝上的果实分为2种（图2），一种是子房略微膨大的未成功受精果实，另一种是子房明显膨大的受精成功果实[16，18]。5月23日，统计受精率（子房明显膨大果实数/授粉花朵数×100%）；7月19日（即果实采收前），统计最终坐果率（成熟果实/授粉花朵数×100%），并采收各授粉组合果实，进行产量及种实性状测定。

图2 授粉15 d后文冠果果实发育情况Figure 2 Fruit development of X.sorbifolium after 15 days of pollination

1.2.5 产量及种实性状测定 果实成熟后（2018年7月19日），按授粉组合采集所有杂交果实，记录果实个数、每果种子数，电子天平称量单果质量、单果种子质量、百粒重，精确到0.01 g。游标卡尺测量果实横径、纵径（各授粉组合均3次重复，每重复10个果实），种子横径、纵径、侧径（种子最宽处厚度）（3次重复，每重复10粒种子），精确到0.01 mm。随机选取各授粉组合种子150粒，取种仁，每重复1 g种仁，3次重复，采用索氏提取法测定种仁含油率[19]。

表1 授粉配置设计Table 1 Pollination configuration design

1.3 数据处理方法

计算每百朵雌能花种子产量=每百朵雌能花果实个数×平均每果种子数×平均单籽质量。出籽率=单果种子质量/单果质量×100%。出仁率=种仁质量/种子质量×100%。

采用Excel 2016统计数据并进行相关图表制作，用SPSS 19.0进行方差分析及主成分分析，用Duncan检验进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 各无性系花期相遇情况

由各无性系花期物候和相遇情况（表2）可知：文冠果5个无性系开花集中在4月27日至5月14日，雌能花、雄能花单花花期7 d左右，雌能花花期为14～16 d，盛花期持续6～7 d，雄能花花期为15～17 d，盛花期持续7～9 d。各无性系雌能花和雄能花盛花期相遇情况：10号、16号雌能花与119号雄能花相遇时间为5 d，与其余无性系雄能花相遇时间为6 d；14号雌能花与119号雄能花相遇时间6 d，与其余无性系雄能花相遇时间为7 d；15号雌能花与所有无性系雄能花相遇时间为6 d；119号雌能花与16号雄能花相遇时间6 d，与其余无性系雄能花相遇时间为7 d。从花期相遇情况看，5个无性系雌能花、雄能花盛花期较一致，相遇时间较长。

表2 文冠果5个无性系花期观测Table 2 Observation of florescence meeting stage of 5 clones of X.sorbifolium

2.2 花期各阶段柱头可授性

根据开花不同天数的雌能花柱头在联苯胺-过氧化氢溶液下的反应情况，判断可授性强弱（表3）。由表3可知：5个无性系柱头可授性表现一致，雌能花花蕾初开放（-1 d）时可授性较弱，此时柱头呈绿色，黏液较少（图1A①）；开花当天（0 d）及花后1 d可授性最强，此时柱头呈淡黄色，三基瓣外翻，乳突细胞体积较大，并可看到大量发亮的黏液分泌（图1A②和1A③）；花后2～3 d可授性较强，此时柱头为暗黄色，乳突细胞体积较大但黏液量较少（图1A④和1A⑤）；花后4～5 d可授性较弱，此时柱头开始干枯变黑，基本无黏液分泌（图1A⑥和1A⑦）。由此可知，文冠果雌能花柱头对花粉接受能力可持续4～5 d。随着开花天数增加，可授性逐渐降低，柱头干枯变黑时，可授性消失。

2.3 不同时期父本花粉活力

由各无性系开花不同时期花粉活力（表4）可知：5个无性系花粉活力均表现出，花蕾初开放（-1 d）和开花当天（0 d）之间无显著差异，两者均显著高于花后1 d的花粉活力。花蕾初开放时，5个无性系花粉活力为84.26%～90.25%，此时雄能花呈钟状，花瓣基部呈黄绿色，2～3个花丝伸长，花药散粉（图1B①）。开花当天5个无性系花粉活力为75.59%～89.12%，此时花瓣平展，花瓣基部为黄色，4～6个花丝伸长，花药散粉（图1B②）。花后1 d各无性系花粉活力最低，为7.91%～15.13%，此时花瓣基部变为浅橙黄色，花丝全部伸长，所有花药均已散粉（图1B③）。文冠果雄能花散粉极快，花后2 d花瓣基部由橙黄逐渐变为紫红，此时已全部散粉（图1B④和图1B⑤）。

表3 文冠果5个无性系开花不同时期柱头可授性Table 3 Stigma receptivity of 5 clones of X.sorbifolium in different flowering stages

表4 文冠果5个无性系开花不同时期花粉活力对比Table 4 Comparison of pollen vitality of 5 clones of X.sorbifolium in different flowering stages

2.4 各授粉组合受精及坐果情况

各授粉组合的受精率和最终坐果情况（图3）表明：以10号无性系为母本（图3A），10×16受精率显著高于其他授粉组合，10×16、10×119和10×15显著提高了10号无性系最终坐果率，与10ck相比，分别提高467.48%、328.83%和206.74%。由图3B可知：人工授粉可以显著提高14号无性系的受精率和最终坐果率；与14ck相比，14×16对母本受精率提高最为显著，14×15对母本最终坐果率提高最为显著。以15号无性系为母本（图3C），仅15×10、15×MP和15×16提高了母本的受精率和最终坐果率；15×14和15×119最终坐果率为0和1.05%，说明14号、119号无性系不适合做15号授粉树。以16号无性系为母本（图3D），与16ck相比，仅16×15显著提高了母本受精率。16×MP组合受精率为0。最终坐果率最高的是 16ck（7.38%）， 其次是 16×15（5.45%）和 16×14（4.00%）。 119号无性系为母本（图 3E）时，各授粉组合受精率为0～3.64%，119×MP对母本最终坐果率提高最为显著，119ck、119×10、119×15最终坐果率均为0。因此，10号、14号、15号、16号无性系均不适合做119号无性系授粉树。

2.5 不同授粉组合对种子产量的影响

对各无性系自然授粉、混合授粉和交互授粉中受精率、最终坐果率排名前3位的授粉组合子代果实进行产量计算和种实性状测定，为便于比较，将种子产量转换成每百朵雌能花种子产量。因10×MP、16×MP、15×119和119号无性系全部授粉组合最终结果个数为0～4，样本数量小，故未进行产量计算和种实性状测定。

由不同授粉组合对种子产量的影响（图4）可知：10号无性系为母本时，10ck产量最低（24.92 g），10×16产量最高（198.02 g），是10ck的7.95倍。以14号无性系为母本，产量从高到低依次为14×15、14×MP、14×10、14×16、14ck，分别是14ck产量的20.44、18.97、12.05和11.36倍。以15号无性系为母本，15×MP、15×10和15×16产量显著高于15ck产量。以16号无性系为母本，产量最高的是16×15（110.82 g），是16ck（27.31 g）的4.05倍。可见，人工授粉可以有效提高文冠果种子产量。

2.6 不同授粉组合对种实性状的影响

图3 文冠果5个无性系受精率和最终坐果情况Figure 3 Fertilization rate and final fruit setting rate of 5 clones of X.sorbifolium

图4 不同授粉组合对文冠果种子产量的影响Figure 4 Effect of different pollination combinations on seed yield of X.sorbifolium

表5为各授粉组合对种实性状的影响（同2.5，仅对计算产量的授粉组合进行统计）。10号无性系作母本，10×16在每果种子数、百粒重和种仁含油率方面均最高，10×15在果实大小及出仁率方面表现较优。以14号为母本，14×16在出籽率、百粒重和出仁率较高方面优于其他授粉组合，14×MP果实横径、纵径、百粒重较小，但每果种子数最多（18.30粒）。人工授粉显著提高了15号为母本的各授粉组合的出籽率。15×MP出籽率最高（53.86%），15×10组合出仁率最高（58.20%），15×16每果种子数最高（20.36粒）。以16号为母本，各授粉组合显著增加了16号果实纵径。16×15的出籽率、百粒重、种仁含油率均最大。

2.7 各授粉组合综合评价

对受精率、最终坐果率、产量及表5中的种实性状指标，共14个指标进行主成分分析，得到各主成分的特征向量、特征值、贡献率及累计贡献率（表6）。其中，前4个主成分累计贡献率达81.21%，能够有效代表各授粉组合种实性状的主要信息。其中F1代表百粒重、种子纵径、种子侧径，归为种子表型及质量；F2主要反映受精率、最终坐果率及产量，归为亲和性及产量因子；F3代表出仁率；F4代表出籽率。

表5 不同授粉组合对种实性状的影响Table 5 Effect of different pollination combinations on fruit and seed characters

根据因子得分的系数矩阵和方差奉献率，得到各主成分以及综合评价函数表达式：

表6 5个主成分的特征向量、特征值、贡献率及累计贡献率Table 6 Eigenvector,eigenvalue,variance contribution and cumulative contribution of 5 principal components

同时，分别以F1、F2、F3、F4对应的方差贡献率作为权数，得到各授粉组合种实性状综合得分。由表7可知：以10号无性系为母本，10ck的F1值最高，说明自然授粉种子表型及质量较大。10×16的F2值最高，说明该组合父本母本亲和性较强，提高母本产量幅度最高。总得分最高的是10×119（34.112），其次为10×16（33.577）。以14号无性系为母本，14ck的F1值最高，说明自然授粉种子表型及质量较大。亲和性及产量因子和总得分均以14×15最高。15号无性系为母本时，10ck的F1值最高，说明自然授粉种子表型及质量较大。15×16的F4值及总得分最高。以16号无性系为母本，F2值及总得分最高的组合均为16×15。

表7 不同授粉组合综合得分Table 7 Comprehensive scores of different pollination combinations

3 讨论与结论

筛选最佳授粉组合的前提是父本雄能花盛花期与母本雌能花盛花期相遇时间较长，以保证充分授粉受精[20]。本研究中，文冠果5个无性系雌能花、雄能花盛花期相遇时间较长（5～7 d），符合授粉树配置花期一致要求。花粉活力直接影响果树授粉、受精及坐果[21]。本研究发现：5个文冠果无性系的雄能花初开放及开花当天花粉活力为75.59%～90.25%，即各无性系均适宜作为授粉无性系。柱头的可授性受花期的长短、开花后的时间以及柱头分泌物等因素影响[22]。如油茶Camellia oleifera[23]开花1～5 d可授性较强，膏桐Jatropha curcas[24]雌花柱头花后1～4 d可授性最强。本研究发现：各无性系柱头可授性在开花当天及花后1 d较强，且持续4～5 d，因此，各无性系可作为授粉母树。

自交不亲和或自交结实率低的树种，如亚洲李Prunus salicina、富士苹果Malus domestica‘Fuji’等，可以通过授亲和性较强的花粉提高坐果率及产量[25-26]。文冠果自交不亲和，自然坐果率较低，只有0.3%～5.1%[27-28]。本研究中，10号、14号、15号和119号无性系自然授粉最终坐果率为0～2.23%，16号无性系自然授粉最终坐果率为7.38%。在花粉活力正常的情况下，不同父本对母本的坐果率影响较大，说明两者亲和力越高，受精率越高，最终坐果率也越高。14×119组合受精率为20.49%，最终坐果率为5.33%，而14×15组合受精率29.43%，最终坐果率为16.14%。由此可见，只有父本、母本亲和性强时，才能提高坐果率，这与刘国彬等[29]在板栗 Castanea mollissima上的研究一致。产量方面，10号、14号、15号和16号无性系均表现出自然授粉显著低于交互授粉中亲和性强的各组合产量，如以14号为母本的授粉组合中，各组合最终坐果率均显著高于14ck最终坐果率，而且，产量是14ck产量的11.36～20.44倍。由此可见，最佳授粉组合筛选可以提高文冠果坐果率及产量。因此，在生产中进行科学的授粉树配置是提高文冠果坐果率及产量的关键。

此外，本研究所选优良无性系均来源于结实率、产量较高的母树，但119号无性系所有授粉组合坐果情况均较差，这说明树木的生长结实表现除了受自身遗传因素影响，还受到环境因素的作用。该无性系原株生长的立地条件、周围授粉树的配置与嫁接苗圃里这些因素的差异都会影响到其表现。因此，生产实践中对所选高产种质资源无性系化推广时，还应考虑环境因素，即授粉树的配置对坐果及结实性状的影响。文冠果成功授粉还受到多方面的影响，因此，今后需要对传粉媒介、授粉效率及促进措施、授粉最佳气候条件、授粉后相应的配套管理技术进一步研究。

综上所述，本研究根据各授粉组合综合评价认为：以10号无性系为母本，综合评价总得分最高的是10×119（34.112），但亲和性及产量因子得分最高的是10×16（33.577），因此，16号和119号无性系均可作为10号无性系授粉树。综合考虑亲和性及产量因子得分和综合评价总得分，14号、15号和16号无性系的最佳授粉组合分别是14×15，15×16和16×15。