2016-2017年四川地区规模化猪场常见病原流行病学调查

江地科，项明源，王 印*，姚学萍，杨泽晓，张鹏飞，廖倡宇，邬旭龙*

(1．四川农业大学动物医学院，四川 温江 611130; 2．动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 温江 611130)

【研究意义】近年来，我国养猪业规模化程度不断提高、畜产品流通异常频繁的同时，病原感染情况也在持续增长，表现为单一病原感染或者多种疾病混合感染以及新变异株的频繁出现。如猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneuromoniae，APP)、猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2, SS2)、猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)等疾病都是造成猪群呼吸道疾病的主要病原[1]。同时，CSFV、PRRSV、PRV、PCV2也是引起猪繁殖障碍疾病的病原之一[2]。猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪轮状病毒(Porcine Rotavirus, PoRV)的感染造成猪群呕吐、腹泻、脱水，具有较高的致死率[3-4]。目前关于四川省养猪业的疾病流行情况调查，现有研究主要针对单一系统性病原调查，【前人研究进展】如：猪群呼吸系统疾病病原调查与分析、猪群繁殖系统疾病病原调查与分析、猪群腹泻病原调查与分析，但未见对猪群各系统主要流行疾病做出全面的调查与分析[5-7]。【本研究切入点】本研究拟采用细菌分离鉴定、RT-PCR和PCR，对四川省2016年1月至2017年12月12个地区的规模化猪场送检病料进行相关病原学检测，调查各病原阳性率，分析疾病发生的季节规律。【拟解决的关键问题】为四川地区猪群相关病原的防控提供有效参考依据，降低疫病给养猪业带来的经济损失。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料样本分别来自2016年1月至2017年12月期间，四川省成都、遂宁、西昌、乐山、绵阳、南充、德阳等12个地区规模化养猪场共283份发病病料，其中病死猪病变组织106份(肺、肾、肝、脾、心等)、公猪精液68份、流产胎和死胎63份、腹泻猪肠黏膜和粪便46份。CSFV、PRRSV、PRRSV NADC30-Like、PCV2、PRV、Pm、SS2、 APP、PEDV和PoRV阳性样品为本实验室保存。

1.2 主要试剂与培养基

反转录酶试剂盒、TSA培养基、蛋白酶K、Tris饱和酚购自宝生物工程(大连)有限公司DL2000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix 购自北京天根生化科技有限公司；小牛血清购自GIBCO公司；异丙醇、三氯甲烷等均由四川西陇化工有限公司生产。

1.3 引物

分别参照GenBank中登录的各病原参考株保守基因序列并参考文献[8-11]进行引物设计与合成，引物送由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.4 细菌的分离鉴定

取病变肺组织划线接种于TSA培养基，37 ℃分别进行需氧与厌氧培养，24～48 h后观察菌落形态，挑取单个菌落进行革兰染色镜检并纯化，提取细菌基因组DNA，-20 ℃保存。

1.5 病料DNA/RNA核酸提取

采用蛋白酶K/Trizol方法提取病料样品总DNA/RNA，-20 ℃保存[12]。

1.6 PCR/RT-PCR扩增

以1.5提取的病料样品基因组DNA为模板(提取的RNA反转录成cDNA)，进行相应样品病原的扩增。PCR反应体系为20 μl：2×TaqPCR Master Mix 10 μl，上、下游引物序列各1.5 μl，模板2 μl，加ddH2O补至20 μl。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；退火(表1)30 s；延伸72 ℃ 1 min，共34个循环；72 ℃ 10 min；4℃保存。取5 μl PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 PCR结果

2.1.1 细菌基因PCR扩增结果 将细菌DNA分别进行PCR扩增，凝胶电泳结果显示分别出现了约为364、495、464 bp的片段，与阳性对照相符，阴性对照无特异性片段出现(图1)。结果显示，分离菌株分别为APP、SS2、Pm。

2.1.2 病毒基因PCR扩增结果 将病料样品RNA/DNA，进行RT-PCR/PCR扩增，结果显示扩增条带分别约为192、400、868、1154、553、774、297 bp，与阳性对照相符，阴性对照均无特异性片段出现(图2)。结果显示，CSFV、PRRSV、PRRSV NADC30-Like、PCV2、PRV、PEDV、PoRV为阳性。

表1 引物序列Table 1 The sequences of Prime

M.DL2000 DNA marker; 1,4,7.APP,SS2,Pm阳性对照; 2,5,8.阴性对照;3,6,9.样品M.DL2000 DNA marker; 1,4,7.APP, SS2, Pm Positive control; 2,5,8.Negative control;3,6,9.Samples图1 APP,SS2,Pm基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of APP, SS2, Pm gene

2.2 病死猪病变组织病原检测结果

2.2.1 病死猪病变组织病原分离统计结果 共检测临床病料106份(心、肝、脾、肺、肾、淋巴结等)。结果显示，病毒PCR检测中 PCV2、PRRSV、PRRSV NADC30-Like、PRV阳性率较高，分别为34.91 %(37/106)、40.57 %(43/106)、20.75 %(22/106)、16.04 %(17/106)(表2)。其中，PRRSV NADC30-Like变异株阳性率20.75 %，是造成猪群死亡的重要原因之一。在细菌分离中，Pm阳性率最高，为19.81 %(21/106)。

2.2.2 病死猪病变组织病料在不同季节病原检测结果 统计以上几种病原在不同季节的阳性率。结果显示，PCV2无明显的季节性，一年四季均可感染；PRV在冬季感染率较高，为28.57 %(10/35)；CSFV在各个季节的感染率均较低；PRRSV在春季、秋季和冬季感染率较高，分别55 %(11/20)、45 %(18/40)、34.29 %(12/35)；PRRSV NADC30-Like在夏季和冬季感染率较高，分别为36.36 %(4/11)和28.57 %(10/35)；Pm在春季和冬季感染率较高为40 %(8/20)和28.57 %(10/35)；APP在夏季感染率较高为27.27 %；SS2在各个季节的感染率均较低(表3)。

2.2.3 病死猪病变组织病料感染结果 猪群发病与死亡的主要原因以病原混合感染为主，混合感染率为60.49 %(49/81)。结果显示，多以二重感染类型为主，占61.22 %(30/49)。此外，PRRSV和PCV2混合其他病原感染最为常见，分别占混合感染样品的44.90 %(22/49)和51.02 %(25/49) (表4)。

2.3 公猪精液病原检测结果

2.3.1 公猪精液病原分离统计结果 共检测精液68份。病毒PCR检测中PCV2、PRRSV、PRV阳性率较高，分别为20.59 %(14/68)、30.88 %(21/68)、20.59 %(14/68)。CSFV较低，为10.29 %(7/68)(表2)。

M.DL2000 DNA marker;1,4,7,10,13,16,19.CSFV,PRRSV,NADC30-Like,PCV2,PRV,PEDV,PoRV阳性对照；2,5,8,11,14,17,20.阴性对照；3,6,9,12,15,18,21.样品M， DL2000 DNA marker; 1,4,7,10,13,16,19.CSFV,PRRSV,PRSSV NADC-30,PCV2,PRV,PEDV,PoRV Positive control; 2,5,8,11,14,17,20.Negative control;3,6,9,12,15,18,21.Samples图2 CSFV,PRRSV,PRSSV NADC-30,PCV2,PRV,PEDV, PoRV 基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification of CSFV,PRRSV,PRSSV NADC-30,PCV2,PRV,PEDV,PoRV gene

表2 不同病原检测结果Table 2 Results of etiological survey of different pathogens

2.3.2 公猪精液病料在不同季节病原检测结果 统计以上几种病原在不同季节的阳性率。结果显示，CSFV在各个季节感染率均较低；PCV2在秋季和冬季感染率较高，分别为31.25 %(5/16)和27.78 %(5/18)；PRRSV在夏季感染率最高，达到70.59 %(12/17)； PRV在夏季、秋季、冬季感染率较高，分别为23.53 %(4/17)、31.25 %(5/16)和27.78 %(5/18)(表3)。

2.3.3 公猪精液病料感染结果 公猪精液带毒主要是由单一病原感染为主，单一感染率为52.63 %(20/38)。PRRSV感染率最高，为45 %(9/20)(表4)。

2.4 流产胎、死胎病原检测结果

2.4.1 流产胎、死胎病原分离统计结果 共检测病料63份。结果显示，病毒PCR检测中 PCV2、PRRSV、PRV阳性率较高，分别为38.10 %(24/63)、46.03 %(29/63)、30.16 %(19/63)。CSFV较低，为6.35 %(4/63)(表2)。

2.4.2 流产胎、死胎病料在不同季节病原检测结果 统计以上几种疾病在不同季节的阳性率。结果显示，CSFV在一年四季基本平静；PRRSV在一年四季均可感染，其中夏季感染率最高为70 %(7/10)；PCV2在夏季、秋季和冬季呈较高感染率，分别为70 %(7/10)、57.14 %(8/14)和38.89 %(7/18)；PRV无明显的季节性，一年四季均可感染(表3)。

2.4.3 流产胎、死胎病原感染结果 仔猪流产和死亡的主要原因是由病原混合感染为主，混合感染率为74.50 %(38/51)。结果显示，以二重和三重感染为主，分别占55.26 %(21/38)和31.58 %(12/38)。以PRRSV混合其他病感染最为常见，分别占混合感染样品的44.74 %(17/38)(表4)。

表3 不同时间病原检测结果Table 3 Results of etiological investigation of different pathogens of different seasons

表4 不同病原混合感染检测结果Table 4 Results of mixed infection of different pathogens

2.5 腹泻猪肠黏膜和粪便病原检测结果

2.5.1 腹泻猪肠黏膜和粪便病原分离统计结果 共检测腹泻病料46份。结果显示，PEDV阳性率最高，为56.52 %(26/46)。PoRV阳性率为26.09 %(12/46)。

2.5.2 腹泻猪肠黏膜和粪便病料在不同季节病原检测结果 统计以上两种病原在不同季节的阳性率。PEDV在春季、秋季和冬季感染率较高，分别为45.45 %(5/11)、28.57 %(2/7)和82.61 %(19/23)；PoRV在春季、秋季和冬季感染率较高，分别为36.36 %(4/11)、28.57 %(2/7)和34.78 %(8/23)。据报道，PEDV具有季节流行性，大多数流行于冬季、春季，但从本次研究结果来看，PEDV除了在冬、春季节流行外，在秋季也多发。

3 讨 论

病死猪病变组织病原调查结果显示，PRRSV阳性率最高，为40.57 %。有研究表明PRRSV可导致感染猪群免疫受到抑制、降低机体免疫力与抵抗力从而导致细菌侵入机体，引发继发性感染，造成猪群大规模死亡[13]。杨汉春等人报道2016年，我国东北部部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒类-NADC30毒株阳性率高达18 %，该毒株持续流行与传播，疫情涉及地区包括北京、河北、山西、四川、广东、河南、福建等地[14]。本研究调查结果显示，PRRSV NADC30-like阳性率为20 %，表明该毒株在四川地区已逐渐呈流行趋势，此外，Zhou Lei等研究表明目前商业PRRSV疫苗不能为NADC30-like提供全面的保护，也是导致猪群死亡的重要原因之一[15]。细菌分离鉴定结果显示，Pm阳性率最高：19.81 %，远高于官正对四川川东部分规模化养殖场猪呼吸道混合感染中Pm(0.55 %)的调查结果[16]。值得注意的是，在细菌分离鉴定过程中，通过PCR也检测到APP、SS2和PRRSV、PCV2等病原混合感染，多以PCV2和Pm二重感染为主，推测其致病过程，可能是由PRRSV和PCV2等病毒性疾病引起猪群免疫受到抑制，使机体免疫降低，从而导致细菌侵入引起继发性感染。

公猪精液与流产胎、死胎病原调查结果显示，PRRSV阳性率最高，阳性率分别为：30.88 %、46.03 %。宋玉慧等对146份临床疑似猪繁殖障碍性疾病的病料调查结果显示，PRRSV阳性率最高，为40.41 %[17]。吴永刚等对四川省部分地区公猪精液六种病毒性疾病的分子检测，结果显示PRRSV阳性率为11.90 %[18]。本研究调查结果表明，引起规模化猪场猪群繁殖障碍疾病主要是以二重感染为主，以PRRSV感染其他病原最为常见。其中，公猪感染繁殖障碍疾病病原后，通常情况下并不表现明显的临床症状，但可作为病毒携带体，通过与母猪交配或人工受精将病原传给母猪，病原经胎盘屏障垂直传播给胎儿，从而引发母猪流产、产死胎和木乃伊等繁殖障碍疾病，是引起目前规模化猪场繁殖障碍性疾病高发病率与死亡率的原因[19-20]。

腹泻猪肠黏膜和粪便病原调查结果显示，PEDV阳性率最高为56.52 %，且主要呈单一感染，是引起猪群腹泻死亡的主要病原。刘云波等、常铁城、曹恭貌等对我国部分地区猪场腹泻病毒感染状况调查结果显示，PEDV阳性率最高[21-23]。此外，Sun等研究证明母猪乳汁也能检测到PEDV，所以PEDV可能通过母乳传播[24]。本研究通过对四川地区部分规模化猪场常见病原的流行病学调查，为相应猪场在疾病防控、流行情况提供一定的科学依据。

4 结 论

本研究主要通过规模化猪场的“猪群呼吸系统疾病病原”、“猪群繁殖系统疾病病原”、“猪群腹泻病原” 三大板块进行调查与分析，发现引起猪群呼吸道疾病和猪群繁殖系统疾病的主要病原还是PRRSV或者是PRRSV混合其他病原进行混合感染，引起猪群腹泻疾病的病原主要还是PEDV。但通过调查发现PRRSV NADC30-like阳性率为20 %，具有上升趋势。本研究通过对四川地区部分规模化猪场常见病源的流行病学调查，为相应猪场在疾病防控、流行情况提供一定的科学依据。