基于线粒体D-loop区序列和Cyt b基因的鲟鱼群体遗传多样性分析

孔 杰，刘 伟，李世凯，周 洲，赵 凤

(贵州省农业科学院 水产研究所，贵州 贵阳 550025)

【研究意义】西伯利亚鲟(A.baerii)和施氏鲟(Acipenserschrenkii)属于鲟科(Acipenseridae)鲟属(Acipenser)，淡水定居鲟种，是我国鲟鱼养殖生产的主要品种。鲟鱼是多倍体起源鱼类，杂交能力强，由于鲟鱼性成熟时间长，亲鱼培育成本高，导致养殖场常忽略鲟鱼繁殖中的遗传背景问题，种质混乱现象普遍，而后备亲鱼的遗传多样性直接影响到苗种质量，因此对后备亲鱼的遗传多样性研究十分必要。【前人研究进展】线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)与核基因组相比，具有变异率高、进化速度快，无组织特异性、母系遗传的特点，被广泛应用于鱼类的群体遗传学研究，如鲟鳇鱼[1-2]、鲤[3]分子鉴定，鲟鱼[4-6]、银鲳[7]、裂腹鱼[8-9]等的遗传多样性和遗传结构研究。mtDNA的不同区域进化速度不同，适合不同水平的进化研究。其中，线粒体控制区(D-loop)位于tRNAPro和rRNAPhe基因之间的控制区，不参与编码蛋白，是mtDNA序列中变异最大的区域，进化速度快，适用于亲缘关系较近群体间的比较研究和种群水平差异检测[10-11]；细胞色素b(Cytb)基因是编码蛋白基因，进化速度适中，适合鱼类的种间和种内遗传分化研究[11-12]。结合D-loop和Cytb分子标记可以更准确地分析鱼类种内遗传变异。【本研究切入点】以施氏鲟和西伯利亚鲟亲鱼群体为研究对象，开展mtDNA Cytb基因和D-loop的序列对比分析，探讨2标记对鲟鱼遗传多样性分析结果的差异与关系。【拟解决的关键问题】旨在扩大研究结果之间横向比较，使结果更客观，评估养殖场施氏鲟和西伯利亚鲟后备亲鱼群体的遗传多样性，为鲟鱼的遗传选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2017年11月在贵州省惠水鲟鱼养殖厂，分别采集西伯利亚鲟亲本尾鳍样本26个，施氏鲟亲本尾鳍样本29个。尾鳍样本固定于无水乙醇中，4 ℃保存备用。

1.2 基因组提取与扩增

剪取约50 mg鲟鱼鳍条样本，液氮研磨至粉末，采用磁珠法基因组DNA(动物)抽提试剂盒(上海生工)进行DNA提取，DNA质量与浓度用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop lite(Thermo Scientific)紫外分光光度计进行测定。Cytb的扩增引物[13]，Cytb-F：5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′，Cytb-R：5′-CTCCATCTCCGGTTTACAAGAC-3′；D-loop区序列的扩增引物[14]，tpro-F1：5′-AACTCCCAAAGCTAAGATTC-3′，phe-R2：5′-ATCCTTTAGTTAAGCTACGC-3′。

PCR反应总体积为50 μl，其中：模板DNA 100 ng，PremixTaq25 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，补充无菌水至50 μl。PCR扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性45 s，54 ℃/56 ℃(D-loop/Cytb)退火45 s，72 ℃延伸90 s/2 min(D-loop/Cytb)，扩增35个循环；最后72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工进行测序。

1.3 数据处理

采用MEGA 6.0 软件对序列进行多重比较，分析序列碱基组成、平均转换/颠换率和变异位点。采用DnaSP 5.0 软件统计获取群体序列遗传多样性参数，如单倍型个数(h)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π)、平均核苷酸差异(K)和Tajima’s D、Fu’s Fs值等。

2 结果与分析

2.1 西伯利亚鲟与施氏鲟的序列对比

2.1.1 Cytb序列 对西伯利亚鲟、施氏鲟Cytb序列测序并经人工序列校正，选择西伯利亚鲟1075 bp、施氏鲟1068 bp进行序列比对。从表1看出，西伯利亚鲟Cytb基因在1075 bp序列中，变异位点5个，均为单突变位点。A、T、C、G碱基的平均含量分别为26.1 %、27.1 %、31.6 %和15.2 %，A+T含量略高于G+C含量，基于最大似然法估算的转换/颠换比为4.0。

施氏鲟Cytb基因在1068 bp序列中，变异位点4个，约占分析位点的0.4 %，其中简约信息位点3个，单突变位点1个。A、T、C、G碱基的平均含量分别为26.7 %、26.9 %、31.9 %和14.6 %，A+T含量略高于G+C含量，基于最大似然法估算的转换/颠换比为3.0。

2.1.2 D-loop序列 对西伯利亚鲟、施氏鲟D-loop全序列测序并经人工序列较正，选择施氏鲟780 bp，西伯利亚鲟994 bp进行序列比对。从表1还可看出，西伯利亚鲟D-loop在994 bp序列中，变异位点2个，约占分析位点的0.2 %，其中简约信息位点1个，单突变位点1个。A、T、C、G碱基的平均含量分别为32.3 %、32.0 %、21.7 %和14.0 %，A+T含量明显高于G+C含量，基于最大似然法估算的转换/颠换比为1.0。

施氏鲟D-loop在780 bp序列中，共有变异位点55个，约占分析位点的7.0 %，其中简约信息位点39个，单突变位点16个。A、T、C、G碱基的平均含量分别为30.2 %、31.6 %、20.4 %和17.8 %，A+T含量明显高于G+C含量，基于最大似然法估算的转换/颠换比为4.2。

表1 西伯利亚鲟和施氏鲟的序列信息 Table 1 Base sequence information of A. baerii and A. schrenkii population

2.2 亲鱼群体遗传多样性

2.2.1 施氏鲟 从表2～3看出，基于D-loop基因，施氏鲟亲鱼养殖群体多态性位点数为55个、单倍型5个、单倍型多样性0.707、核苷酸多样性0.02242、平均核苷酸差异16.906。共定义了5个单倍型，其中Hap5为优势单倍型，代表14个个体，占总体个数的48.3 %。

基于Cytb基因，施氏鲟亲鱼养殖群体多态性位点数为4个、单倍型4个、单倍型多样性0.612、核苷酸多样性0.00114、平均核苷酸差异1.221。共定义了4个单倍型，其中Hap2为优势单倍型，代表17个个体，占总体个数的58.6 %。

2.2.2 西伯利亚鲟 从表2～3还可看出，基于Cytb基因，西伯利亚鲟亲鱼养殖群体多态性位点数为5个、单倍型多样性0.151、核苷酸多样性0.00036、平均核苷酸差异0.385。共定义了3个单倍型，其中Hap1为优势单倍型，代表24个个体，占总体个数的92.3 %。

基于D-loop基因，西伯利亚鲟亲鱼养殖群体多态性位点数为2个、单倍型多样性0.385、核苷酸多样性0.00040、平均核苷酸差异0.400。共定义了3个单倍型，其中Hap1为优势单倍型，代表20个个体，占总体个数的76.9 %。

2.3 中性检验

从表4看出，西伯利亚鲟群体基于Cytb和D-loop的Tajima’s D值分别为-2.0020和-0.50721，Fu’s Fs值分别为-0.527和-0.445，可推测在西伯利亚鲟亲鱼群体中低频率等位基因占主导作用。

表2 西伯利亚鲟和施氏鲟的遗传多样性参数Table 2 Genetic diversity of A. baerii and A. schrenkii population

表3 基于Cyt b和D-loop序列的单倍型在西伯利亚鲟和施氏鲟群体中的分布Table 3 Distribution of haplotype in Cyt b and D-loop sequences of A. baerii and A. schrenkii population

表4 西伯利亚鲟和施氏鲟的中性检验结果Table 4 Neutrality test of A. baerii and A. schrenkii population

施氏鲟群体基于Cytb和D-loop的Tajima’s D值分别为0.3826和0.8636，Fu’s Fs值分别为0.674和17.108，且其P值不显著，表明该群体未经历过种群扩张。

3 讨 论

3.1 西伯利亚鲟与施氏鲟的Cyt b、D-loop序列信息

线粒体基因组中A、T、G、C的分布呈不均一性[15]，而碱基A+T含量高的线粒体基因在进化中更具优势[16]。本研究西伯利亚鲟、施氏鲟D-loop的A+T含量分别为64.3 %和61.8 %，大于其Cytb的A+T含量，表明碱基组成具有偏倚性。施氏鲟群体D-loop的A+T含量高于牛翠娟等[6]研究的施氏鲟群体(57.9 %)，与王巍等[5]研究的施氏鲟群体(61.8 %)和西伯利亚群体(62.2 %)的含量相当。由此推断，本研究施氏鲟和西伯利亚鲟群体的D-loop比Cytb基因在进化中更具优势。

在生物体进化中颠换不断积累，因此转换/颠换比不断减小，一般认为转换/颠换比小于2时，基因序列突变已经达到饱和状态[17]。本研究西伯利亚鲟D-loop的转换/颠换比小于2，表明突变已达饱合状态。

基于Cytb和D-loop分析施氏鲟群体的Tajima’s D和Fu’s Fs值为正值，表明施氏鲟群体的中等频率等位基因占主导，该种群在经历瓶颈时使稀有等位基因丢失，且其P值不显著，表明该群体未经历过种群扩张。基于Cytb和D-loop分析西伯利亚鲟群体的Tajima’s D和Fu’s Fs值均为负值，表明西伯利亚鲟群体中存在许多稀有等位基因，可能是在定向选择中削弱了原有等位基因在群体中的频率。

3.2 西伯利亚鲟与施氏鲟的遗传多样性

遗传多样性是鱼类遗传育种的一个重要参考指标，其高低意味着生物适应生存能力的强弱，多样性越高生物体便有越丰富的育种和遗传改良潜力[18-19]。衡量一个种群mtDNA的遗传多样性有2个重要指标：单倍型多样性(Hd)和核苷酸多态性(π)[20]。π值考虑了各种mtDNA单倍型在群体中所占的比例，因此反映一个群体多态程度往往比单纯的遗传距离平均值更准确，π值高则说明种群的遗传多样性较高[21]。

牛翠娟等[6]通过D-loop序列对施氏鲟群体的遗传多样性分析显示，核苷酸多样性(π)为0.011，单倍型多样性(Hd)为0.768，认为后备亲鱼有一定的遗传变异程度。王巍等[5]对鲟鱼的遗传多样性分析显示，施氏鲟(π=0.002，Hd=0.608)、西伯利亚鲟(π=0.005，Hd=0.706)后备亲鱼群体遗传多样性偏低。从其他鱼类的遗传多样性看，香鱼群体[22]D-loop的π=0.00199、Hd=0.81075，Cytb的π=0.00028、Hd=0.323，其群体遗传水平较低；赤眼鳟野生群体[11]D-loop的π=0.0284、Hd=0.963，Cytb的π=0.0426、Hd=0.9710，具有较高的遗传多样性水平。本研究基于mtDNA Cytb基因、D-loop序列研究的遗传多样性显示，西伯利亚鲟Cytb的π=0.00036、Hd=0.151，D-loop的π=0.0040、Hd=0.385；施氏鲟Cytb的π=0.00114、Hd=0.612，D-loop的π=0.02242、Hd=0.707；施氏鲟群体的遗传多样性略高于西伯利亚鲟群体，但与上述多样性丰富的鱼类相比，西伯利亚鲟、施氏鲟后备亲鱼群体的遗传多样性均较匮乏。因此，在繁殖中应注意引进其他产地的亲鱼，以增加现有后备亲鱼群体的遗传多样性。

本研究初步反映了西伯利亚鲟、施氏鲟亲鱼群体的遗传背景、遗传结构以及遗传变异水平，但mtDNA标记与核基因标记并不成正相关关系。可以结合核基因组分子标记如SSR、SNP，以更全面的展示该群体的遗传多样性，为亲鱼选育、苗种培育提供更充分的理论依据。

4 结 论

施氏鲟和西伯利亚鲟群体的D-loop比Cytb基因在进化中更具优势；西伯利亚鲟D-loop区突变已达饱合状态；施氏鲟群体的中等频率等位基因占主导，该群体未经历过种群扩张，西伯利亚鲟群体中存在许多稀有等位基因；西伯利亚鲟、施氏鲟后备亲鱼群体的遗传多样性均较匮乏。