鱼苗规格对草鱼细菌二联苗浸泡免疫接种效果影响

巩 华 钟国东 赵长臣 江小燕 赖迎迢

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部渔药创制重点实验室，广东省免疫技术重点实验室，广东 广州 510380；2.韶关市始兴县农业农村局，始兴县鱼类繁育良种场，广东 韶关 512500)

鱼用疫苗因其可安全有效地预防水产养殖动物疫病，已成为国际上水产疫病防控的主流技术。其中，浸泡免疫可对鱼群进行免疫，操作简单、短时间内实现批量接种、对鱼刺激小、鱼种接种效果更佳，具有良好的推广价值，目前在欧美、东亚等不少国家和地区都有商品化产品，都有浸泡免疫操作方法推荐(吴淑勤等，2014)。浸泡免疫接种时，疫苗效力存在许多变量，其中受免鱼的大小是重要考虑因素之一。特别是浸泡免疫过程中，通过大量研究表明，抗原摄取主要依赖于吞噬作用经过黏膜组织如硬骨鱼的鳃、皮肤、侧线和胃肠道(Bøgwald J等，2019)，其系统发育是否完善严重影响免疫应答效果。

草鱼嗜水气单胞菌败血症、铜绿假单胞菌赤皮病二联蜂胶灭活疫苗(GA201 株＋JP802 株)在小样本、小范围、环境恒定可控条件下的浸泡免疫安全性、效力等试验表明，该疫苗对草鱼安全、有效。为科学评价该疫苗在实际生产应用中的安全性、效力和使用效果，笔者开展了不同规格的草鱼种浸泡免疫的效果试验，评估该疫苗在草鱼产业中的操作使用参数值，以期为生产实践和科学研究等提供数据支撑。

一、材料与方法

1.试验材料

(1)疫苗。草鱼嗜水气单胞菌败血症、铜绿假单胞菌赤皮病二联蜂胶灭活疫苗(GA201 株＋JP802 株)均为中国水产科学研究院水产疫苗工程技术中心试制产品，经安全性检验和效力检验合格。

(2)苗种培育池。池塘位于韶关市始兴省级良种场生产车间内，为泥底池塘、水泥护坡。池塘面积为5 亩，水深2 米左右，配置叶轮式增氧机1～2 台，在距离投饵机20 米处安装1 台水车式增氧机。试验前全池泼洒生石灰清塘。

(3)草鱼苗种。自繁水花培育至0.35 克/尾，鱼群采食、游泳正常，无其他传染病。渔场按正常免疫程序进行免疫，经检测无携带草鱼出血病呼肠孤病毒、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等病原后，分别准备规格0.35 克/尾(7 朝)、0.65 克/尾(8 朝)、1.05 克/尾(9 朝)、2.30 克/尾(10 朝)的草鱼苗种。

2.试验方法

(1)试验分组。试验方案见表1。

表1 试验分组与处理情况统计

(2)饲养管理。控料投喂，投饵率为5%～8%，每天7:00、11:30、16:00 按1∶1∶1 均匀投喂。内服保健主要为复合多维和乳酸菌、酵母菌等微生态制剂。

(3)水质管理。墨江水经引流、沉淀、过滤后引入池塘，生石灰泼洒调节碱度120～150毫摩尔/升、硬度80～120毫摩尔/升、pH 7.5～8.5。日常检测水质，当氨氮、亚硝酸盐超过规定范围即调水、换水，pH 超出范围则用碳酸氢钠和生物酸调节，溶氧超出范围则调整增氧机的开关时间，透明度超出范围则进行换水。每10～15 天换水1次，一般每次换水30厘米。

(4)浸泡免疫。按照产品使用说明，配制0.5%的食盐水(100升水加1千克食盐)，加入10瓶疫苗(100 毫升/瓶)，浸泡鱼苗20 分钟，完成100 千克鱼苗浸泡，浸泡过程中要不间断充气。

(5)健康状况。观察鱼体健康状况，特别是免疫接种后观察鱼群的精神、采食、游泳情况，观察有无应激反应、是否出现死亡。通常早晨、傍晚及投料摄食期间为最佳观察时间，静候在塘边下风处，观察草鱼的活动情况，若疫苗安全性不佳，能见病鱼出现；静候投料台边观察草鱼摄食情况，以判断鱼的健康状态。

(6)统计免疫后死亡情况。每天记录各组的死亡数，1个月后计算各组死亡率，按下列公式计算免疫相对保护率。

(7)内脏解剖。出现死亡后，鱼的肝、脾、肾和肠道等器官充血、糜烂，有腹水。两个月后试验结束时，每批各随机取20 尾试验鱼进行剖检，观察注射部位有无炎性反应或其他反应，并观察各脏器是否正常。

二、结果

1.养殖期间水质与管理情况

试验期间(6－7月)水温受到季节影响，7月晴天1.5 天，多云11.5 天，其余都是雨天，雨天比较多，7 月26－30 日气温达到37℃以上，水温保持在26℃左右，增氧机开得比较多，会影响草鱼苗的成活率。中间培育过程中，由于考虑到高温雨季，根据经验放苗密度不大，整个过程中没有出现大的问题，试验期间4号池和6号池发生车轮虫病，对所有试验池使用硫酸铜杀虫后，没有发生其他传染病。

2.浸泡免疫对鱼苗成活率的影响

本试验各种规格的草鱼苗合计36 万尾，其中浸泡免疫18 万尾，在试验1 个月后，开始陆续出苗，发送到粤北、赣南、湘南等地区，由于距离和时间关系，没有一一追踪。1个月的试验时间内生产情况如表2所示。从统计结果来看，免疫后成活率都有增长，8 朝苗以上保护率可达30%以上，9朝苗的免疫保护率最高，可达50.20%。在本场内草鱼种生长良好，体长达10～12 厘米，成活率达到75%以上。

3.浸泡免疫对鱼苗生长的影响

本试验免疫操作过程适逢雨季，天气变化快，闷热天气气压低，因此免疫接种需要全过程不间断增氧。在养殖期间鱼苗生长良好，免疫组和非免组饵料系数均在1.5 以上(图1)，差异不显著(P＞0.05)。从规格上看，免疫处理后对生长的影响不大，由于7 号、8 号对照池的成活率不高，其养殖密度降低，养成的规格反而大于免疫组，可见密度才是影响其生长的主要因素。

图1 试验期间各养殖池饵料系数统计

4.鱼类解剖结果

试验结束时随机取样检测表观健康的鱼苗，鱼苗内脏完好，无出血、腹水等炎性反应；肠道内有食物，可见其摄食正常；鳃基本正常(图2)。各个池塘内均有少量鱼有黏液增多现象，可能由于雨季或其他原因引起的应激反应。

图2 鱼苗培育后的解剖情况(2号池、6号池)

表2 各组生产情况统计

三、讨论

免疫系统发育是决定起始免疫时间的重要因素之一，20 世纪80 年代有学者开展鱼类免疫系统发育研究。免疫系统未发育完善进行免疫易产生免疫耐受(吴淑勤等，2014)。免疫耐受是指对抗原特异应答的T细胞和B细胞接受某种抗原刺激后表现出的特异性免疫低应答或无应答状态，即机体对某种抗原无免疫应答的状态。一般研究参考陆生动物指标，以鱼体孵化后的日龄作为免疫操作的指标，如鲤鱼受精后2 天可见免疫器官，3～8 个月免疫器官发育成熟，但4 周龄鲤鱼免疫后产生抗原耐受(Becker K等，2001)。

也有研究认为，鱼体规格(体重或体长)大小是获得免疫应答能力的关键因素。Nuno等(2001)接种个体重大于1克的鲑鱼和0.5克的鲈鱼才能成功获得特异性免疫，且体重与免疫应答效果正相关，推测能产生免疫应答的最小体重与免疫器官发育成熟日龄相一致。免疫器官发育成熟日龄和体重可作为起始免疫适宜时间和规格指标参数。草鱼、鲤的头肾发育不同于恒温动物，不只受到日龄的影响，其他内外环境因素对器官生理的影响也至关重要(雷学彬等，2012)，因而用全长或体质量等形态学指标作为头肾等免疫系统发育的参考十分必要。

珠三角地区草鱼养殖通过多年的积累和实践，形成了清晰的草鱼朝苗养殖判定标准，并广泛运用于草鱼苗的标粗阶段(把刚刚孵化并开口的鱼苗培育到体长10厘米左右的鱼种阶段)，并对草鱼朝苗不同规格的过筛形成行业内标准化操作。苗种成活率是草鱼苗种培育最为关注的课题，成活率的高低关系着养殖成本、养殖产量的高低、出售规格的大小、鱼价行情的把握，是整个草鱼养殖环节中最为重要的一环，以苗种成活率来评价所采取的措施是最基础的评价方式之一。在本试验中，8朝苗以上保护率可达30%以上，9朝苗的免疫保护率最高，可达50.20%。因此该疫苗联合使用浸泡免疫接种时，鱼种的规格在9 朝左右为宜。