快生长分枝杆菌软组织感染的鉴定及耐药性分析

周 佳， 金 博， 肖 楠， 黄 磊， 孙立颖

（1.北京大学第一医院检验科，北京 100034； 2.北京清华长庚医院检验科，北京 102218）

快生长分枝杆菌（rapidly growing Mycobacterium，RGM）可引发软组织感染和肺部感染等多种疾病[1]。RGM主要分为偶发分枝杆菌复合群、龟-脓肿分枝杆菌复合群和耻垢分枝杆菌复合群，这些亚种复合群的共同点是都具备特征性的长链脂肪酸——分枝菌酸，7 d内可在多种固体培养基上快速生长出肉眼可见的菌落，3 d～2周保持芳基硫酸酯酶活性，并且不产生或较慢产生任何色素[2-3]。偶发分枝杆菌复合群包括2个已知种和1个至少包括1个种的不明分类群[4]，鼻疽分枝杆菌、塞内加尔分枝杆菌、偶发分枝杆菌等一系列分枝杆菌都属于这个复合群[5]。龟-脓肿分枝杆菌复合群[6]还包括2001年被发现的Mycobacterium immunogenum[7]。耻垢分枝杆菌复合群包含Mycobacterium goodii和Mycobacterium wolinskyi[8]。在分子生物学证据出现之前，龟-脓肿分枝杆菌复合群和偶发分枝杆菌复合群中的成员被认为是亚种或只是不同血清型，但16S rDNA测序结果证实这些血清型或亚种其实更有可能是不同的种。本研究选取北京大学第一医院2010年以来分离到的3株RGM，其中2株是泌尿外科手术切口感染病原菌，另外1株是外伤感染病原菌，分别采用激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）检测和16S rDNA、rpoB基因测序进行菌种鉴定，并分析其药物敏感性，以加强临床对RGM的认识。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集北京大学第一医院2010年以来分离自3例患者的3株RGM。（1）患者1。男，22岁。既往体健，否认传染病和遗传病史。自诉1年前左足曾被钉子扎伤2个月后局部肿胀化脓，合并左腹股沟淋巴结多发肿大，右侧胸腔积液，发热，经外院诊断为分枝杆菌感染。经清创及抗菌治疗后创面愈合。后左足脓肿复发，清创换药后伤口愈合出院。4个月后再复发，脓液送检验科细菌室，检出RGM。（2）患者2。女，52岁。因“右肾上腺囊肿”，于外院行腔镜手术，术后低热，右腰部切口红肿、破溃、流脓、不愈，清创缝合术后切口再次红肿破溃，B超提示右腰部瘢痕下积脓，自诉患高血压、慢性乙型肝炎6年，病情平稳，否认患其他慢性病。伤口脓液送细菌室进行细菌培养，并查抗酸杆菌，结果阴性。手术扩创后取坏死组织再送检验科延长培养时间查致病菌，结果回报确认RGM。（3）患者3。男，60岁。否认有慢性病史。4个月前因左肾积水和无功能于外院行左侧输尿管切除术。手术成功，且无术后感染迹象，遂出院。3个月前无诱因发现左腰部原引流口有血性渗出液，未明确诊断病原菌，伤口迁延不愈形成窦道，后经窦道内肉芽组织培养，确诊RGM感染。

1.2 仪器与试剂

哥伦比亚血平皿（英国OXOID公司），抗酸染色液[贝索（中国）公司]，质谱仪（德国Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养与鉴定 样本接种于哥伦比亚血平皿，35℃ 5% CO2条件下培养72 h，形成特征性菌落。采用MALDI-TOF MS进行菌种鉴定，并进行抗酸染色，同时送菌悬液进行16S rRNA和rpoB基因测序，16S rRNA引物为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；rpoB引物为：5'-CGACCACTTCGGCAACCG-3'和5'-TCGATCGGGCACATCCGG-3'。

1.3.2 体外药物敏感性试验 采用E-test法对3株RGM进行体外药物敏感性试验，折点参考美国临床实验室标准化协会M24-A2文件[9]。配制0.5麦氏单位浓度的菌悬液，以哥伦比亚血平皿为培养基，72 h后判读结果；对克拉霉素的药物敏感性7 d后判读结果。

2 结果

2.1 RGM感染患者临床特征总结

3例RGM感染患者中，2例泌尿系手术后伤口形成感染性窦道，1例足部外伤后感染，并累及腘窝淋巴结。3例患者病程均在4个月以上，感染创口和窦道均较深，除抗菌药物治疗外，均需外科切开清创引流，引流液、脓液无臭味，创面可产生肉芽组织，并受累淋巴结炎性反应。抗菌药物用药时间均在1个月以上，期间可继发金黄色葡萄球菌等细菌感染。3例患者均无导致免疫抑制的基础病。

患者1：手术2个月后左足脓肿未检出分枝杆菌，结核菌素实验++，伤口脓液检出铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌；术后4个月查体见左足小脓包破溃，左腘窝出现软质包块，触之有轻压痛，切口按压可有少量脓液，左腹股沟可及肿大淋巴结。临床使用左氧氟沙星0.75 g，每日1次；利福平 0.6 g，每日1次；克拉霉素0.5 g，每日2次。1个月后伤口愈合良好，出院。

患者2：查体见手术切口瘢痕长5 cm，红肿，隆起，3个小伤口，流脓，脓液无臭味。伤口约9 cm深，很窄，仅容12号尿管通过，内可刮出炎性肉芽组织。电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）结果示窦道深，范围广，近腰大肌及肾上腺手术区域（图1）。剪开创面清创引流后，使用左氧氟沙星0.75 g，每日1次；利福平0.6 g，每日1次；克拉霉素0.5 g，每日2次。创口逐渐痊愈，6周后出院。

图1 患者2 CT窦道造影

患者3：1个月前因左腰部伤口仍有血性渗出液流出，入院后CT结果见图2。伤口分泌物培养结果为RGM，给予左氧氟沙星等抗感染治疗1个月，无明显改变。查体见左腰部前方一外口约0.5 cm窦道，深度约11 cm，负压吸引可见棕褐色引流液，左腰部稍后方可见1处外口约1.5 cm溃疡，深度约4 cm，无渗出，皮肤无红肿，取引流液进行培养，再次确认生长RGM。给予阿奇霉素0.5 g，每日1次；左氧氟沙星0.75 g，每日1次化疗1个月后病情稳定，带药出院。

图2 患者3 CT窦道造影

2.2 细菌鉴定结果

患者1有疑似RGM菌落生长，分纯后取48 h生长菌落进行鉴定，质谱鉴定结果为鼻疽分枝杆菌，基因测序结果亦为鼻疽分枝杆菌；患者2有疑似RGM菌落生长，分纯后取48 h生长菌落进行鉴定，质谱鉴定结果为分枝杆菌属，基因测序结果为偶发分枝杆菌，取信测序结果，鉴定为偶发分枝杆菌；患者3有疑似RGM菌落生长，分纯后取48 h生长菌落进行鉴定，质谱鉴定结果为脓肿分枝杆菌，基因测序结果亦为脓肿分枝杆菌，鉴定为脓肿分枝杆菌。3株分纯后的菌株生长速度均较快，72 h生长菌落形态见图3。

图3 鼻疽分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌培养72 h结果

2.3 体外药物敏感性试验结果

对M24-A2文件[9]上有折点的药物（阿米卡星、亚胺培南、妥布霉素、头孢西丁、复方磺胺甲噁唑、环丙沙星、利奈唑胺和克拉霉素）进行药物敏感性试验，此外还增加了医院临床常用的抗菌药物，包括左氧氟沙星、利福平和阿奇霉素的最小抑菌浓度报告。3株细菌对阿米卡星、妥布霉素、亚胺培南和利奈唑胺均敏感，对复方磺胺甲噁唑均耐药。见表1。

表1 3株RGM体外药物敏感性试验结果

3 讨论

本研究选取2010年至今北京大学第一医院3例软组织RGM感染病例，1例是外伤后慢性创口和淋巴结感染鼻疽分枝杆菌，2例是泌尿外科术后切口感染偶发分枝杆菌和脓肿分枝杆菌形成深度超过10 cm的窦道。由于某些尚不清楚的原因，RGM感染病例基本都集中在北半球的发达国家，推测可能和诊断治疗水平有关[10-11]。美国2007年发布的《诊断治疗和预防非结核分枝杆菌指南》[11]可见，美国分离的RGM绝大部分都是肺部感染来源，只有3%的淋巴结感染和3%的软组织感染来源。亚洲地区的病例情况也类似，肺部感染病例最多[1，10]。欧洲以慢速生长的堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌等为主，亚洲，尤其是东亚，以RGM（偶发分枝杆菌复合群、龟-脓肿分枝杆菌复合群以及耻垢分枝杆菌复合群）感染病例为主[10]。有文献报道的软组织感染爆发包括手术后感染、外伤感染和注射后脓肿等[12-14]。污染菌的来源为年久失修的供水管道系统，未消毒彻底的内镜或气管镜等[13]。在我国台湾省北部一家医疗中心内曾经出现过RGM的爆发[15]。

很多R G M 感染与患者免疫抑制状态有关[11-12]，但是开放性创伤后RGM感染也可发生于免疫正常者[11-12]。本研究的3个病例都不伴有造成免疫抑制状态的基础疾病，外伤或手术破坏了表皮组织的屏障作用是导致感染发生的先决条件。

本研究分离出的1株鼻疽分枝杆菌和1株偶发分枝杆菌都是偶发分枝杆菌复合群的成员，根据相关研究结果[13，15]和诊断治疗指南[11]，偶发分枝杆菌和耻垢分枝杆菌对于很多口服抗菌药物都比较敏感，100%敏感的药物包括左氧氟沙星、环丙沙星和磺胺类，但是对头孢西丁和多西环素只有50%的敏感可能性。治疗时至少要采用2种药物联合。因为治疗时间往往长达1年，药物的选择和患者的耐受性有关。对于严重的皮肤、骨骼、软组织偶发分枝杆菌感染，最少应采用2种药物治疗4个月，骨骼感染推荐治疗6个月。对于较大范围感染，脓肿形成，或药物治疗存在困难时应采取手术方式。本研究病例普遍采取了切开引流的有创操作，或者去除导管或假体等感染源头。本研究中第3个病例分离出的是脓肿分枝杆菌。脓肿分枝杆菌天然对标准的抗结核治疗药物耐药[16]，而且由于脓肿分枝杆菌种群内部药物敏感性的异质性，分离出的每个菌株都推荐依照体外药物敏感性试验结果进行药物治疗。虽然相关指南[11]认为未经治疗的脓肿分枝杆菌对克拉霉素100%敏感，但是2002年我国台湾的研究结果显示，脓肿分枝杆菌对克拉霉素的敏感率只有50%左右，对头孢西丁和亚胺培南敏感率也较低[13，15]。对于皮肤软组织感染，相关指南[1]推荐的治疗方法是克拉霉素1 g/d，或阿奇霉素250 mg/d，合并使用胃肠外药物（阿米卡星或头孢西丁或亚胺培南）。敏感性最强的胃肠外药物是阿米卡星，推荐疗程和鼻疽分枝杆菌相同，都是最少4个月。必要时辅以外科手术[10]。最近的研究结果显示，由于很多RGM菌株都含有一种红霉素核糖体甲基化酶，这种酶可被缓慢诱导产生，因此对于克拉霉素等大环内酯类抗菌药物的药物敏感性试验的报告时间应延长至14 d[17]。本研究7 d之后观察，2株RGM的克拉霉素药物敏感性试验结果都是中介，脓肿分枝杆菌结果是耐药，提示大环内酯类抗菌药物应限制用于RGM的治疗。

本研究中分鼻疽枝杆菌和偶发分枝杆菌感染病例都经验采用左氧氟沙星+阿奇霉素+利福平的疗法。虽然没有可以依据的折点，但是通过最小抑菌浓度判断，这2株RGM均对左氧氟沙星敏感，鼻疽分枝杆菌对阿奇霉素耐药，偶发分枝对阿奇霉素敏感。本研究中3例患者治疗效果均很好，2例患者经手术清创引流，最后都痊愈出院。而从最小抑菌浓度分析，脓肿分枝杆菌对阿奇霉素敏感，左氧氟沙星的最小抑菌浓度较高，最后出院时也未做到完全痊愈。符合脓肿分枝杆菌治疗较偶发分枝杆菌复合群困难的特点。

综上所述，本研究中3株RGM的药物敏感性试验结果与文献[10-11，13-18]基本一致。RGM因较罕见，本研究结果可为临床进一步认识RGM，并有效治疗RGM感染提供帮助。