肝细胞肝癌复发前后CD3高表达T淋巴细胞的变化

金方方， 金子铮， 刘 宁， 娄金丽

（首都医科大学附属北京佑安医院临检中心，北京 100069）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌的90%以上，居我国恶性肿瘤病因的第4位，肿瘤致死病因的第3位，全球每年有50%以上的HCC新发病例和死亡病例发生在我国[1-2]。HCC起病隐匿、早期症状不典型，多中心发生，发现时多处于中晚期且伴随不同程度的肝硬化，手术切除率低，具有易早期播散、转移的特点。目前，临床常用的HCC治疗方法有手术切除、肝动脉导管化疗栓塞、射频消融、肝移植等。这些治疗方法虽然能去除局部的病灶，但远期效果并不十分理想，术后5年复发率高达75%[3]，术后5年生存率仅为30%～40%[4]。因此，寻找与肝癌术后复发相关的指标有助于尽早发现复发的肿瘤，改善患者预后。在外周血单个核细胞中有一类具有CD3高表达现象的T淋巴细胞（CD3brightT细胞），该群细胞分布广泛，具有反应迅速、升高明显、增殖能力强、持续时间长等免疫反应特点，与感染及肿瘤的发生、发展密切相关[5]。本研究拟探讨CD3brightT细胞在HCC患者术后复发中的提示作用，为HCC临床诊疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2013年1月—2018年6月首都医科大学附属北京佑安医院确诊为HCC的患者69例，其中男53例、女6例，年龄49～72岁；69例患者中，有47例患者接受抗病毒治疗，22例患者未接受抗病毒治疗。TNM分期Ⅰ期19例、Ⅱ期32例、Ⅲ期8例。所有患者均有完整的病历资料及长期门诊复诊或住院治疗记录，具体时间间隔为：术后半年内每月复查1次肝脏电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）或B超、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、肝功能，半年后每3个月复查1次，2年后每6个月复查1次，以术后5年或死亡为研究终点。复发以影像学诊断为准，如B超、CT、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、肝动脉造影等，单纯AFP升高不作为复发的标准。所有患者术前均有乙型肝炎病史，均无糖尿病、甲状腺功能异常以及自身免疫性肝病等自身免疫性疾病史，且均未进行过免疫治疗。根据临床资料统计患者5年内的复发情况：5年内复发52例，未复发17例。

1.2 病例入选、排除标准

入选标准：经术后病理或肝穿刺病理活检确诊为HCC的患者。排除标准：肝功能异常（术前Child-Pugh分级为C级）；术前有感染，如肺炎、腹膜炎、尿路感染等；术后病理或肝穿刺病理活检未证实为HCC；失访。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 根据HCC临床分期及肝功能情况，经临床术前准备、保肝治疗后，行肝叶切除、肝叶不规则切除或介入（肝动脉化疗栓塞、射频消融）治疗。

1.3.2 相关指标的检测 分别采集所有患者术后1个月、复查及复发时的静脉血4 mL，乙二胺四乙酸抗凝，充分混匀，采用荧光抗体CD3-藻红蛋白花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PeCy5）、CD8-藻红蛋白-德克萨斯红（phycoerythrin and Texas red tandem，ECD）、CD4-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）（美国BD公司）标记淋巴细胞，用溶血剂溶解红细胞，离心，弃上清，用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗2次，采用BD FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）进行检测。采用Kaluza Analysis软件（美国Beckman Coulter公司）分析CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞分别占总T细胞的百分比（CD3%、CD4%、CD8%），计算CD4/CD8比值。设门圈出CD3brightT细胞占CD3+T细胞的百分比（CD3bright%）。同时采用cobas e601全自动免疫分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂（电化学发光法）检测血清AFP水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件及GraphPad Prism 7软件进行统计分析。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用非参数Mann-Whitney U检验。采用Logistic回归分析（前向逐步法）评估各项目对HCC复发的提示作用。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD3bright T细胞表型特征分析

CD4+CD8双参数设门显示CD3brightT细胞不表达CD4分子，少部分表达CD8分子，主要为CD4-CD8-T细胞。见图1。

图1 CD3bright T细胞表型特征分析

2.2 复发组与未复发组各项指标的比较

复发组AFP、CD4%、CD8%高于未复发组（P＜0.01），CD3bright%低于未复发组（P＜0.01）。CD3%和CD4/CD8比值2个组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 HCC复发患者术后及复发时各项指标的比较

与术后比较，复发时患者血清AFP水平明显升高（P＜0.01）、CD3bright%降低（P=0.04），其他指标2个组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.4 AFP、CD3%、CD4%、CD8%、CD4/CD8比值及CD3bright%与HCC术后复发的关系

单变量Logistic回归分析结果显示，AFP、CD3%、CD8%及CD3bright%与HCC术后复发有关[比值比（odds ratio，OR）分别为1.012、1.033、1.048和0.841，95%可信区间（confidence interval，CI）分别为1.001～1.023、1.006～1.060、1.016～1.081、0.785～0.900。

多变量Logistic回归分析结果显示，AFP、CD3bright%与HCC术后复发独立相关（OR值分别为1.012和0.841，95%CI分别为1.001～1.023和0.783～0.902）。见表3。

表1 复发组与未复发组各项指标的比较 M（P25～P75）

表2 复发患者术后及复发时各项指标的比较 M（P25～P75）

表3 AFP、CD3%、CD4%、CD8%、CD4/CD8比值及CD3bright%与HCC术后复发的单变量和多变量Logistic回归分析结果

3 讨论

HCC的发生、发展与机体的免疫功能密切相关，针对HCC的免疫学研究一直是重点和热点。以T细胞为主导的细胞免疫反应在HCC患者免疫监视、杀伤和调节中扮演着重要角色。T细胞主要分为CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群。CD4+辅助T细胞可直接或通过分泌细胞因子，如干扰素-γ（interferon gamma，IFN-γ）、干扰素-α（interferon alpha，IFN-α）等起杀伤肿瘤细胞的作用[6]。CD8+细胞毒性T细胞和CD4+细胞毒性T细胞分别通过人类白细胞抗原Ⅰ类和Ⅱ类实现对肿瘤细胞的监视及杀伤作用。抗肿瘤T细胞数量减少和功能障碍可减弱机体对肿瘤细胞的杀伤作用，抑制性调节T细胞数量增加可抑制机体免疫功能，导致肿瘤细胞发生免疫逃逸[7-8]，促进肿瘤的复发与转移。由此可见，T细胞亚群在HCC的发生、发展中发挥着重要作用，但与HCC复发的关系尚不明确。本研究结果显示，复发组CD4%、CD8%高于未复发组（P＜0.01），CD4/CD8比值差异无统计学意义（P＞0.05）。提示CD4/CD8比值虽可在一定程度上反映HCC患者免疫系统的紊乱，但对于复发的提示作用有限。

根据T 细胞表面C D 3 分子的表达可区分C D 3brightT 细胞亚群。C D 3brightT细胞亚群在健康人群中普遍存在，有8 0%～8 4%的人均可检测到该细胞群，占外周循环中T 细胞的3.1 5%±2.6 0%[5，9]。本研究结果显示，HCC患者CD3brightT细胞主要为CD4-CD8-T细胞，与文献报道一致[5，9]。PAGET等[10]对纯化的CD3brightT细胞进行特征分析，CD3brightT细胞为γδT细胞，主要分布于皮肤及黏膜等屏障部位，在早期防御病原体中发挥重要作用。CD3brightT细胞还共表达趋化因子受体6（chemokine receptor 6，CCR6）和趋化因子受体2（chemokine receptor 2，CCR2）。当发生炎症时可通过下调白细胞介素（interleukin，IL）-23介导的稳态受体CCR6，驱动CD3brightT细胞快速聚集到远处的炎症部位，参与屏障部位以外的免疫反应[11]。CD3brightT细胞在肿瘤的进展中也扮演着重要角色。作为固有免疫细胞，CD3brightT细胞可通过提供IFN-γ等炎性细胞因子发挥抗肿瘤作用[12-13]。目前，对IL-17介导的促肿瘤学说尚存在争议。有研究结果显示，CD3brightT细胞可通过分泌IL-17，促进肿瘤部位血管的生成及肿瘤细胞的生长转移[14]。还有研究结果显示，IL-17可通过促进肿瘤部位中性粒细胞的浸润与活化而抑制肿瘤的生长[15]。BAO等[16]的研究结果显示，非小细胞肺癌患者外周血中CD3brightT细胞水平低于健康人。本研究结果显示，术后5年内复发的HCC患者外周血CD3brightT细胞水平显著低于未复发患者，且在复发时进一步降低。多变量Logistic回归分析结果显示，AFP、CD3bright%与HCC术后复发独立相关（OR值分别为1.012和0.841，95%CI分别为1.001～1.023和0.783～0.902）。较低的CD3brightT细胞水平与HCC较差的预后及高复发率相关，具体机制还有待进一步研究。

总之，较低的CD3brightT细胞水平与HCC较差的预后及较高的复发率有关。对CD3brightT细胞在HCC患者免疫抑制状态中的作用进行研究有助于为HCC患者的免疫治疗提供新的靶点。由于本研究为回顾性分析，且回顾时间为5年，可持续跟踪的病例数有限，因此有关CD3brightT细胞在HCC中的作用还有待进一步深入研究。