rs3804100、rs3804099及rs2295080基因多态性与黑龙江省2型糖尿病患者并发肺结核关系的研究

陈海军 薄璐 郭鑫 张堃 赫丽杰 李强 李雨泽

我国是结核病大国，同时也是糖尿病大国，2017年我国结核病新发患者约为88.9万例，糖尿病患者约为1.14亿例[1-2]。研究显示，糖尿病患者是并发活动性肺结核的高危人群，且二者结合后疾病预后差，复发率、死亡率均明显上升[3-5]，加大了临床中2型糖尿病并发肺结核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DMTB)治疗和控制的难度。目前关于T2DMTB的病因研究成为了热点，其中从遗传学角度探讨炎症因子基因多态性与T2DMTB的关系为学者们在T2DMTB的病因学研究中打开了思路。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水准上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，SNP会影响个体对一些疾病易感性发生改变。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是免疫系统中重要的模式识别受体，在先天性免疫和获得性免疫中发挥抗感染作用[6]。Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)是TLR中的重要成员，研究显示TLR2在抗结核中至关重要[7]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种属于磷酸肌醇3-激酶家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，研究表明mTOR有抗菌、免疫抑制和抗癌等特性，在细胞生长、增殖凋亡等过程中起着重要的调节作用[8-10]。本研究对黑龙江省部分T2DMTB患者与单纯2型糖尿病患者TLR2的rs3804100、rs3804099位点及mTOR的rs2295080位点的基因多态性进行检测，探讨这3个位点的基因多态性与2型糖尿病并发肺结核的关系。

材料和方法

一、研究对象

观察组患者男199例，女101例；年龄20～87岁，平均(51.97±11.87)岁。对照组患者男171例，女129例；年龄20～87岁，平均(58.73±11.46)岁。

二、纳入及排除标准

纳入标准：对照组符合2型糖尿病的诊断，诊断标准见文献[13]；观察组除符合2型糖尿病的诊断，同时符合肺结核的诊断，诊断标准见文献[14]。排除标准：非黑龙江省人群，非汉族人群，艾滋病、病毒性肝炎(乙、丙型)、梅毒患者，并发各种肿瘤、结缔组织疾病、其他内分泌疾病患者。

三、质量控制

1. 调查员培训：所有参与书写病例的医师均经过统一培训，明确录入受试者信息的目的和意义，充分掌握录入信息内容的标准及注意事项。本研究统一规定了基本信息录入表的填写方法、相关定义说明、样本的采集及保存方法。

2. 录入信息的核实：所有参与书写病例的医师均经过主治医师及以上级别医师培训，通过查找患者找到研究所需要的受试者信息，在查找取得的患者信息不完整时，应与受试人群当面进行信息核实。

四、研究方法

(一)收集血清及资料

采集患者外周血2 ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，低温静置，在4 ℃下以4500×g离心15 min后分离出上清液即血清样本，存放于-80 ℃冰箱。收集T2DMTB、2型糖尿病患者基本资料，包括患者姓名、病历号、性别、年龄、身高、体质量等。

(二)实验过程

1. 血液DNA提取：采用北京天根生化科技有限公司生产的血液(细胞或组织)基因组DNA提取试剂盒提取血液DNA，按照说明书步骤进行操作。

2. PCR扩增：使用定性PCR扩增仪(7500 Fast型，美国Life公司)、Taqman探针法及Roche LightCycler480检测系统(瑞士罗氏公司)对基因进行分型。在每96孔板中随机选择1～2个空白对照，每个SNP信号都在满足形成3个明显分型点聚集簇的情况下，由LightCycler480的Endpoint Genotyping 软件完成基因型分析。对于每个SNP位点，随机选择5%的样本重复检测[13]。探针信息：rs3804100，购于美国ThermoFisher公司，货号为4351379， ID为C_ _25607727_10；rs3804099，购于美国ThermoFisher公司，货号为4351379，ID为C_ _22274563_10；rs2296080，购于美国ThermoFisher公司，货号为4351379，ID为C_ _16189146_10。荧光定量PCR反应体系见表1。

表1 荧光定量PCR反应体系及条件

五、统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料以“率(%)”表示。采用χ2检验对基因TLR2、mTOR的rs3804100、rs3804099、rs2295080位点在T2DMTB与2型糖尿病人群之间的分布差异进行比较，并进一步采用logistic回归分析3种基因位点在两组患者间的分布差异，采用后退法，带入回归模型的分类变量赋值，见表2。均以P<0.05为差异有统计学意义。

表2 logistic回归模型中分类变量赋值情况

注T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；G：鸟嘌呤

结 果

1. 3种位点等位基因在观察组和对照组之间的分布：TLR2的2个基因位点rs3804100、rs3804099及mTOR的rs2295080位点的等位基因在观察组和对照组中分布差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表3。

2. 各因素与T2DMTB发病关系的单因素分析：两组患者性别、年龄在观察组和对照组中分布差异均有统计学意义(P值均<0.05)，TLR2的2个基因位点rs3804100、rs3804099及mTOR的rs2295080位点在观察组和对照组中分布差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表4。

表3 观察组和对照组中等位基因的对比分析

注a：胞嘧啶；b：鸟嘌呤；等位基因频率=等位基因频数/600×100%

表4 各因素与T2DMTB发病关系的单因素分析

注T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；G：鸟嘌呤；年龄分组考虑到本研究收集的患者主要集中在≥50岁人群，<50岁人群例数较少，且疾病变化较≥50岁人群慢，故合并为一组，而≥50岁人群按每10岁为年龄段进行分组

3. T2DMTB发病的logistic多因素分析：因单因素分析后显示年龄、性别在两组患者间的分布差异有统计学意义，所以将年龄和性别带入logistic回归模型中与分析变量一起进行多因素分析。结果显示，TLR2及mTOR各基因位点多态性与T2DMTB之间均无相关性(P值均>0.05)。见表5。

表5 各因素与T2DMTB发病关系的logistic多因素分析

讨 论

糖尿病与肺结核相互影响，相互促进。糖尿病患者一般因为机体代谢紊乱而不能满足对营养的基本需求，因此免疫功能低下，机体感染结核分枝杆菌的概率增加。有研究显示，2型糖尿病患者感染肺结核的概率是普通人感染肺结核的4～8倍[15]。同时，结核病又会加重糖尿病病情，消耗机体大量能量，加重糖尿病患者血糖的波动[16]。Toll样受体和mTOR是免疫防御体系中重要的炎症因子，它们SNP位点的改变会影响正常的信号转导、转录水平，甚至影响蛋白质功能和免疫应答，从而使机体对某些感染的易感性增加。一些研究表明，TLR及mTOR均与机体抗结核免疫水平密切相关[12, 17]，且通过阅读大量文献可以得知TLR2的rs3804100、rs3804099位点及mTOR的rs2295080位点与2型糖尿病的发生、发展及并发症密切相关[18-20]。在大量的文献报道中[12,17-20]，不乏关于基因位点与单纯结核病、单纯糖尿病、糖尿病并发其他并发症(非结核性)分别相关的研究，但关于基因位点与已经发生糖尿病的患者易感结核病的研究分析并不多见，所以本研究对黑龙江省部分T2DMTB患者与单纯2型糖尿病患者中TLR2的rs3804100、rs3804099位点及mTOR的rs2295080位点的基因多态性进行检测，探讨这3个位点的基因多态性与T2DMTB的关系。

logistic分析结果显示，TLR2的rs3804100、rs3804099位点及mTOR的rs2295080位点的基因多态性均与T2DMTB无关。分析原因首先可能是因为样本量还不够大；且由于研究群体为黑龙江省人群，不能代表其他地区人群也有相同结论；如之前有研究显示，在河北省石家庄人群中rs3804099的CC基因型与结核易感性有关[21]，但本研究中并未得出此结论，可能跟地区、人群差异有关。另外，本研究中没有纳入健康人群作为对比，由于两组均为2型糖尿病患者，有可能在两组患者中都存在3个位点的基因多态性。并且也没有通过ELISA试剂盒检测TLR2、mTOR在患者血清中的水平；研究中只检测了3个位点的基因多态性，TLR2、mTOR均与肺结核相关，途径中可能存在其他位点及单倍型[22]；其次本研究仅通过校正控制了年龄、性别在两组中的均衡性，并没有对其他可能影响基因多态性与疾病关系的因素进行控制，也可能对结果产生偏倚。

在今后的相关研究中，需要继续扩大样本量，并纳入一部分匹配的健康人作为对照；并对影响因素如体质量指数，是否吸烟、饮酒，空腹血糖情况，是否口服降糖药，是否使用胰岛素等在组间的均衡性进行严格控制。同时对TLR2及mTOR的其他位点进行分析，并对患者进行相关血清分子学检测，从分子水平、基因水平及其他水平共同分析探讨，丰富完善对TLR2及mTOR基因多态性与T2DMTB关系的研究。