SIX1 和TGF-β对原代人喉鳞癌细胞上皮—间质转化的影响

张继华，董凯峰，苏静，李丹，田君海

大量实验显示，上皮—间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在诱导恶性肿瘤局部浸润和远处转移过程中起着不可替代的作用。这一过程是由多个信号传导途径触发和调控的，这些信号途径能够对细胞外的刺激产生应答而激活。在这些传导途径中，转化生长因子-β(TGF-β)途径被认为是最重要的途径之一[1-2]。以往研究表明，SIX1同TGF-β相互作用能够促进多种恶性肿瘤细胞淋巴结转移[3]，推测SIX1及TGF-β在喉鳞癌细胞中表达的变化，会进一步影响肿瘤细胞上皮—间质转化的过程，进而影响喉癌的转移，但它们之间的相互作用机制及对喉癌细胞EMT的影响尚未见报道。本研究通过原代细胞培养，对喉鳞癌细胞中SIX1、TGF-β及上皮标志物E-cadherin的mRNA及蛋白表达进行了检测， 旨在探讨人喉鳞癌细胞上皮—间质转化过程中SIX1 和TGF-β的相互作用及机制，为临床诊治提供理论依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)试剂试药：SIX1免疫组化用多克隆抗体(工作浓度为1∶75)、TGF-β免疫组化用多克隆抗体(工作浓度为1∶55)由武汉博士德公司提供， E-cadherin免疫组化用多克隆抗体(工作浓度为1∶50)由北京奥维亚生物技术有限公司提供，免疫组化用S-P染色试剂盒、DAB显色用试剂由北京中杉金桥公司提供。转染用SIX1和TGF-β试剂盒由美国Invitrogen公司提供。胎牛血清(购自杭州四季青生物材料研究所)置于-20℃冰箱低温保存备用。 胰蛋白酶(购自GIBCO公司，北京邦定生物医学公司分装)。用D-hank’s液配成0.25%溶液，无菌条件下滤过孔径 0.22 μm的混合纤维素微孔滤膜，无菌分装后，-20℃冰箱低温保存备用。硫酸庆大霉素注射液(辅仁药业有限公司)。 (2)仪器设备： MCO175型二氧化碳培养箱(日本三洋产品)。CX-PC-2型倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 原代细胞培养:收集2016年1月—2018年1月河北医科大学第一医院耳鼻咽喉科行喉鳞状细胞癌手术患者21例，均留存切除组织，置于4℃的0.9%氯化钠注射液中无菌保存。部分组织块尽快转移至实验室超净台，进行处理并原代细胞培养，修剪留取新鲜、正常肿瘤组织，庆大霉素杀菌处理15 min，0.9%氯化钠注射液冲洗2次，将组织块剪碎(初步使组织块分离成单细胞)，庆大霉素液冲洗2次，0.9%氯化钠注射液冲洗2次，加入Ⅰ型胶原酶消化1 h，每间隔10 min进行一次吹打混合，促进喉癌组织块分解成单个肿瘤细胞。消化结束后，生理盐水冲洗细胞混合液2次，加入细胞培养液，内含20%胎牛血清，将细胞悬浊液接种于6孔灭菌细胞培养板，上述接种的细胞转移至培养箱，常规培养48 h。取出培养板，培养孔内加入消化用胰蛋白酶，利用杂质细胞(成纤维细胞为主)与喉鳞癌肿瘤细胞对胰蛋白酶消化作用不同，而出现不同细胞脱离培养板底壁时间差异，去除杂质细胞。反复进行上述纯化，直至得到纯化的肿瘤细胞。待其稳定传代后，对培养细胞进行鉴定并确认为鳞状细胞癌细胞(由2名高年资病理科医生共同鉴定)，扩增细胞，进行试验。

1.2.2 原代细胞转染及分组: 待细胞生化稳定后，制作SIX1 siRNA、TGF-β siRNA和SIX1+TGF-β siRNA，siRNA转染至原代人喉癌细胞，沉默细胞内的SIX1、TGF-β及SIX1+TGF-β基因表达。具体步骤如下，接种原代人喉鳞癌细胞至6孔细胞培养板，每孔肿瘤细胞量约为3×105个，每孔内加入细胞培养液约2 ml，放于培养箱，常规培养过夜。观察细胞生长状态，单层细胞量约60%汇合时进行试验。A溶液配制(用于转染的纯DNA 2 μg加入不含血清培养液中，最终体积约100 μl)，B溶液(LipofectAMINE 100 μl，加入不含血清培养液中，最终体积120 μl)，混合A和B 2种溶液，轻摇匀，室温下放置30 min。用细胞培养液2 ml轻洗涤肿瘤细胞，培养孔内加入细胞培养液(不含血清)0.8 ml，加入上述复合物，轻轻摇动混匀混合液，转移至细胞培养箱，常规孵育24 h。用完全细胞培养基替换孔内转染液，继续培养48 h， PCR法对SIX1、TGF-β及SIX1+TGF-β表达检测，检测确定转染成功后分组：未转染组、空转组、SIX1转染组、TGF-β转染组及SIX1+TGF-β转染组。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 免疫细胞化学法检测SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表达：消化原代人喉鳞状细胞癌细胞，用细胞培养液配制细胞悬液，使其浓度为1×105个/ml， 取24孔细胞培养板，板内置已灭菌玻璃片，每组设6孔，向孔内灭菌玻璃片上接种肿瘤细胞，每孔接种上述细胞悬液1滴。细胞移至细胞培养箱，常规培养4 h，倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，待玻璃片上>80%细胞已经贴壁，向培养板内加DMEM培养液每孔约1 ml。培养箱中培养48 h，培养板内肿瘤细胞已达80%～90%汇合，取出培养板，PBS溶液冲洗1次，甲醛溶液固定10 min，PBS溶液冲洗2次，每次5 min。留取玻璃片上爬片细胞，参照免疫组化试剂说明，进行爬片细胞免疫荧光染色，盖玻片封存，镜检。

结果判断。采用半定量双评分法，倒置荧光显微镜高倍镜视野下根据阳性细胞所占比例及细胞绿色荧光强度做综合判定。高倍镜下视野内阳性细胞比例：阳性细胞比例<25%，记0 分；阳性细胞比例25%～50%，记1 分；阳性细胞比例51%～75%，记2 分；阳性细胞比例>75%，记3分。表达强度评分标准，未见荧光或仅见极弱荧光， 记0 分；荧光微弱但明显可见，记1 分；荧光可见且光色明亮，记2 分；荧光可见且光色闪亮， 记3 分。2种方法所得评分相加为总分，得分0～1分为目的蛋白阴性(-)； 2分为目的蛋白弱阳性(+)； 3～4分为目的蛋白阳性(++)， 5～6分为目的蛋白强阳性(+++)。

1.3.2 Western-blot法检测肿瘤细胞内SIX1、TGF-β、E-cadherin蛋白表达：参照试剂说明书，提取样本蛋白，制备Western-blot检测样品，检测各组样品蛋白浓度，常规上样，配制选用12%分离胶及4%浓缩胶，每组样品上样量65 μg，同时设置Marker预染蛋白，100 V电泳约85 min，转膜30 V，0.9 mA过夜。洗膜，定影后进行图像分析。

1.3.3 RT-PCR法测定各组肿瘤细胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA：Trizol法提取样本肿瘤细胞总RNA，检测各组样本细胞浓度，确定样本细胞RNA完整，cDNA反转录合成，取转录产物2 μl进行PCR反应。GAPDH引物序列上游 5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3' ,下游 5'-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3';SIX1引物序列上游5′-CCACTAGAAGAGGAATT-3′，下游5′-CACGCCGGAGCCAAACT-3′，产物大小254 bp，退火温度56.3℃； TGF-β引物序列上游 5′- CTGTAATTCTGCTGTAATA-3′，下游 5′-GGCTTAGTATTCTGGGAAA-3′，产物大小287 bp，退火温度54.2℃；E-cadherin引物序列上游5'-AGGCCAAGCAGCAGTACATT-3' ，下游5'-ATTCACATCCAGCACATCCA-3，产物大小为288 bp，退火温度为56.6℃。反应条件如下，94℃变性1 min，57℃复性1 min，75℃延伸1 min，共设计32个循环，最后设计75℃延伸10 min。以GAPDH的荧光表达量度作为检测基因表达参照量。

2 结 果

2.1 免疫细胞化学法检测各组人喉鳞癌细胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表达比较 与未转染组比较，空转组细胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。与未转染组比较，SIX1转染组SIX1蛋白表达明显下调，TGF-β蛋白表达无明显差异；TGF-β转染组TGF-β蛋白表达明显下调，SIX1蛋白表达无明显差异；SIX1+TGF-β转染组SIX1蛋白及TGF-β蛋白表达均明显下调(P<0.01)。与未转染组比较，SIX1转染组、TGF-β转染组及SIX1+TGF-β转染组E-cadherin 蛋白表达均上调，差异均有统计学意义(F/P=6.846/0.006)。TGF-β转染组、SIX1转染组及SIX1+TGF-β转染组比较，E-cadherin蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)，见图1、表1。

表1 免疫细胞化学法检测各组细胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表达水平比较分)

图1 各组喉鳞癌细胞中E-cadherin表达情况(免疫荧光染色，×100)

2.2 Western-blot法检测各组人喉鳞癌细胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表达比较 与未转染组比较，空转组细胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。与未转染组比较，SIX1转染组SIX1蛋白表达明显下调，TGF-β蛋白表达无明显差异；TGF-β转染组TGF-β蛋白表达明显下调，SIX1蛋白表达无明显差异；SIX1+TGF-β转染组SIX1蛋白及TGF-β蛋白表达均明显下调(P<0.01)。与未转染组比较，SIX1转染组、TGF-β转染组及SIX1+TGF-β转染组E-cadherin 蛋白表达均上调，差异有统计学意义(F/P=13.396/0.000)，TGF-β转染组、SIX1转染组及SIX1+TGF-β转染组比较，E-cadherin蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 RT-PCR法测定各组人喉鳞癌细胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表达水平比较 与未转染组比较，空转组细胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。与未转染组比较，SIX1转染组SIX1 mRNA表达明显下调，TGF-β mRNA表达无明显差异；TGF-β转染组TGF-β mRNA表达明显下调，SIX1 mRNA表达无明显差异；SIX1+TGF-β转染组SIX1 mRNA及TGF-β mRNA表达均明显下调(P<0.01)。与未转染组比较，SIX1转染组、TGF-β转染组及SIX1+TGF-β转染组E-cadherin mRNA表达均上调，差异有统计学意义(F/P=9.673/0.000)，TGF-β转染组、SIX1转染组及SIX1+TGF-β转染组比较，E-cadherin mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)，见图2、表3。

注： A.空转组；B.未转染组；C.SIX1转染组；D.TGF-β转染组； E.SIX1+TGF-β转染组

图2 E-cadherin mRNA 在各组人喉鳞癌细胞中的表达情况

3 讨 论

上皮—间质转化(EMT)是指肿瘤上皮细胞在一定的环境及相应转化因子等因素共同影响下逐步转变成充质细胞的现象。目前多数学者认为，EMT是恶性肿瘤生长、转变的过程之一，与恶性肿瘤细胞的局部浸润及远处淋巴结转移紧密相关。EMT转化的过程主要表现为原肿瘤上皮细胞极性逐渐消失，上皮细胞与周围其他细胞的接触相应减少，细胞间的连接包括黏附连接及紧密连接减少，使得细胞脱离的机会增加，易于发生局部浸润及远处迁移；EMT的发生会出现原有上皮细胞表型的转变，其上皮表型如E- eadherin、角蛋白丝等消失，间质表型纤维连接蛋白、N-钙黏素等逐渐形成。其中代表细胞间黏附力的E-cadherin表达下降是EMT的主要表现，也被视为EMT转化的标志[4]。实验研究表明，EMT与肿瘤细胞向局部浸润和淋巴转移的过程密切相关，EMT可诱导多种恶性肿瘤细胞局部浸润和淋巴转移，如卵巢癌、肝癌、结肠癌及恶性黑色素瘤等[5-8]。因此，EMT被认为是多种上皮来源肿瘤转移潜能的标志。

表2 Western-blot法检测各组细胞SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表达水平比较

表3 RT-PCR法检测各组细胞SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表达水平比较

上皮—间质转化的过程是由多个信号传导通路触发和调控的，在这些信号传导通路中，TGF-β被认为是最重要的途径之一。TGF-β能够通过MAPK (mitogen-activated protein kinases)通路、SMAD通路及Wnt通路等途径对肿瘤的浸润及转移进行调节，在大肠癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中均存在TGF-β的高表达，其表达强度与肿瘤的分化、淋巴结转移及预后密切相关[9-11]。以往的研究证实，TGF-β能够被细胞中的多种活性因子激活，并与这些因子共同作用，激活及影响细胞内多种传导通路，但肿瘤细胞中转录因子的高表达能否增强TGF-β途径在诱导人喉鳞癌EMT过程中的作用尚不清楚。

SIX1(sine oculis homeobox homolog 1)是一种与细胞成熟相关的细胞因子，在发育成熟的细胞内很少表达，然而最近研究表明，SIX1在多种恶性肿瘤组织中却呈现出高表达，SIX1能够影响Cyclin A1、Cyclin D1及Ezrin 等多种下游编码基因的表达。SIX1在卵巢癌、乳腺癌、肝细胞癌等多种恶性肿瘤中表达强度与肿瘤的预后密切相关[12-14]。最近研究证明，SIX1 能够与TGF-β共同作用，并通过SMAD2/3途径调节VEGF等多种基因的表达，进而发挥其促进肿瘤细胞淋巴结转移功能，基于以上研究结果，本研究探讨SIX1与TGF-β是否在人喉鳞癌EMT的过程中起着促进作用。

Sun等[15]的研究结果显示，SIX1能够同 TGF-β共同作用促进卵巢癌细胞上皮—间质转化，进一步提高卵巢癌细胞局部浸润及远处转移的能力。本结果也发现，喉癌细胞内SIX1表达降低的同时出现了E-cadherin mRNA及蛋白表达的上调，同样，TGF-β表达降低的同时也出现了喉癌细胞E-cadherin mRNA及蛋白表达的上调，差异均有统计学意义(P<0.01)。说明SIX1及TGF-β均参与了人喉鳞癌细胞EMT的过程，SIX1和/或TGF-β表达降低均能抑制人喉鳞癌细胞EMT的发生。同时，本研究结果还显示，抑制TGF-β表达、抑制SIX1表达同抑制SIX1+TGF-β表达均能导致人喉鳞癌细胞E-cadherin mRNA及其蛋白表达的上调，且3组间E-cadherin mRNA及其蛋白的表达差异无统计学意义。提示在人喉鳞癌细胞EMT的过程中TGF-β及SIX1并不能单独发挥作用，而需要TGF-β和SIX1共同作用。SIX1和TGF-β共同诱导人喉鳞癌细胞EMT的过程是通过TGF-β及SIX1共同作用途径实现的。推测SIX1在人喉鳞癌细胞中表达升高能够增强TGF-β对肿瘤细胞的敏感性，进而通过TGF-β途径促进喉鳞癌细胞的上皮—间质转化。与此同时，TGF-β促进喉鳞癌细胞上皮—间质转化的过程需要SIX1的存在，但其具体的作用机制尚待进一步研究。

综上，SIX1 、TGF-β共同作用可能是人喉鳞癌细胞上皮—间质转化的关键，SIX1和TGF-β是人喉鳞癌细胞转移潜能的重要标志，有望成为临床治疗人喉鳞癌上皮—间质转化及淋巴结转移的新靶点。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张继华：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写，论文修改；董凯峰：实施研究过程，资料搜集整理；苏静：进行统计学分析；李丹：实施研究过程，资料搜集整理，论文撰写；田君海：提出研究思路，分析试验数据，论文审核