去细胞羊膜载体复合自体子宫内膜干细胞治疗重度宫腔粘连1例报道

黎佳敏，林姣，彭婀娜，黄洁琼，黄向红

(湘潭市中心医院，湘潭 411100)

一、病例资料

患者38岁，因“月经紊乱20年，结婚8年，未避孕未孕8年”诊断为“原发不孕、多囊卵巢综合征”，在湘潭市中心医院进行辅助生殖治疗。

2012年诊断“多囊卵巢综合征”，间断口服达英35(2.04 mg，1次/d)治疗，服药期间月经正常，停药后月经紊乱。月经初潮12岁，(7/30～90)d，经量正常。

门诊促排卵3个周期，有优势卵泡形成，指导同房未孕。改为卵泡期长方案促排卵，行体外受精-胚胎移植助孕，2014年5月3日移植2枚新鲜胚胎，获双胎妊娠(双绒毛膜双羊膜囊)，孕6+月自然流产，流产后行清宫术，考虑可能是宫颈机能不全导致流产，建议行宫颈环扎术，患者拒绝该手术。2015年10月23日因患者强烈要求，移植2枚冻胚，再次获双胎妊娠(双绒毛膜双羊膜囊)，建议行减胎术及宫颈环扎术，患者拒绝，再次孕6+月自然流产，并行清宫术。清宫术后月经量极少，经期1 d，1片护垫即可。2018年9月至2018年11月拟再次行冻胚移植术，在内膜准备阶段，B超监测发现内膜薄、欠连续，考虑宫腔粘连。

2018年12月11日行第一次宫腔镜手术，同时行宫腔镜检+宫腔粘连分离+子宫内膜息肉摘除+取子宫内膜干细胞培养+上球囊+透明质酸钠宫腔灌注，术中见宫腔失去正常形态、下段封闭(图1 A)，B超引导下分离粘连后，基本恢复宫腔形态，双侧壁及前后壁下段内膜缺失，左侧宫角见少许内膜组织，左侧输卵管开口处见一处息肉，术后宫腔深7.5 cm。术后诊断：宫腔粘连，美国生育学会(AFS)宫腔粘连评分为10分，子宫内膜息肉。

2019年1月11日复查宫腔镜，同时行宫腔粘连分离+子宫内膜息肉摘除+宫腔置入节育器负载去细胞羊膜载体与自体子宫内膜干细胞的复合体(制备方法：收集术前四项阴性并排除其它感染的剖宫产产妇的羊膜，剪裁为10 cm培养皿大小的羊膜片，去细胞处理后冻干保存。使用时，将冻干的去细胞羊膜复苏，使羊膜完全贴附于培养皿底，按照1×105/cm2的密度接种自体子宫内膜干细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁，细胞形态会逐渐变成细长梭形，即可使用。此次干细胞细胞量为3×106个)。术中见：宫腔右侧致密粘连，右侧宫角封闭，左侧宫角处见致密粘连带，累及宫腔范围1/2，术前双侧宫角及输卵管开口均不可见(图1B)。微剪分离宫腔粘连后宫腔形态大致正常，予中号宫型节育器置入宫腔，术后双侧宫角及输卵管开口均可见，右侧壁内膜缺失，腺体开口稍少。术后诊断：宫腔粘连(AFS评分为6分)，子宫内膜息肉，宫内羊膜，宫内节育器。术后辅助人工周期治疗，月经量明显改善，经期3 d。

2019年3月5日行第3次宫腔镜，术中行宫腔粘连分离+取环+羊膜取出+球囊宫腔内放置+自体子宫内膜干细胞宫腔移植(干细胞细胞量为6×106个)+透明质酸钠宫腔灌注。术中见：右侧宫腔中上段致密粘连，宫内节育器嵌顿于粘连带内，右侧壁内膜缺失，前壁中下段内膜缺失(图1C)。术后诊断：宫腔粘连(AFS评分为6分)。5 d后取出球囊。

2019年4月4日行第4次宫腔镜。术中见：两侧壁内膜缺失，前后壁及宫底内膜薄并有草莓样充血，右侧宫腔中上段致密粘连累及宫腔范围<1/3(图1D)，行宫腔粘连分离+透明质酸钠宫腔灌注。术后抗感染治疗，并予替代周期+低分子肝素皮下注射准备子宫内膜。2019年4月19日黄体酮转化内膜，冻胚移植前1 d行阴道彩超检查提示内膜达到8.5 mm，C级(图2)。2019年4月24日移植一枚早期囊胚，移植后12 d测血HCG为616.2 U/L，移植后28 d经阴道B超提示“宫内妊娠，单活胎”。嘱孕12～14周产科就诊行宫颈环扎术，定期产检。

A：第1次宫腔镜；B：第2次宫腔镜；C：第3次宫腔镜；D：第4次宫腔镜图1 四次宫腔镜手术视野

图2 移植术前经阴道B超结果

二、讨论

宫腔粘连又称Asherman综合征，多由于宫腔手术操作、宫腔内感染、介入手术、放射线等原因导致子宫内膜基底层被破坏，从而造成宫腔和/或宫颈管粘连，导致患者出现月经异常、不孕甚至反复流产等一系列临床表现。宫腔粘连会影响子宫内膜容受性，导致不孕并严重影响辅助生殖的临床妊娠率。

宫腔粘连分离术后极易复发，其中轻中度宫腔粘连的复发率约23%，重度宫腔粘连的复发率约62%[1]。手术是治疗宫腔粘连的必要手段[2]，手术治疗的目的是恢复子宫腔正常解剖学形态，扩大宫腔容积，分离或切除瘢痕组织，保护残留内膜，治愈相关症状。但术后预防宫腔粘连复发及帮助子宫内膜恢复和重建更为重要[3]。子宫内膜具有良好的容受性是胚胎着床成功的关键因素[4]。因此，宫腔镜下宫腔粘连分离术后的综合管理极为重要。目前宫腔粘连术后预防复发及恢复内膜的治疗方法主要有：人工周期治疗、宫腔内置入节育器、宫腔内置入球囊、药物改善子宫内膜血液循环治疗(如阿司匹林、低分子肝素等)、粒细胞集落因子刺激治疗(皮下注射或宫腔灌注等)[5-6]。人工周期需要在子宫腔残留一定面积的子宫内膜基础上发挥作用，对于残留子宫内膜面积不足宫腔面积1/3且出现闭经或点滴经血临床表现的重度宫腔粘连患者及高龄薄型子宫内膜患者，常规使用人工周期效果欠理想，需要新的思路开拓有效的治疗方案[7]。

目前干细胞治疗成为多学科的热点，妇产科也不例外。有研究者构建了宫腔受损的小鼠模型，经干细胞治疗后验证干细胞具有重建子宫内膜及预防宫腔粘连的效果[8]，但是用于临床宫腔粘连患者尚鲜有报道。干细胞可分为全能干细胞和多能干细胞，其中多能干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞，具有很强的多向分化和自我更新潜能[9]。成体干细胞可来源脐带、脐血、羊膜、胎盘[10]，并且广泛分布于骨髓、肝脏、肾脏、子宫内膜及肌层、输卵管等多个部位[11]。作为成体干细胞的子宫内膜干细胞在特定诱导条件下可分化为子宫内膜细胞，并且可以多次传代扩增，且不存在免疫排斥，这些特性都为干细胞治疗重度宫腔粘连及帮助子宫内膜修复提供了理论基础[12]。因自体子宫内膜干细胞容易取材、分离简单、易体外培养，且具有增殖快、成瘤性低和安全可靠等特点，近年来成为组织器官再生修复的关注热点[13]。育龄期女性每个月经历的子宫内膜剥脱和再生提示了子宫内膜干细胞的存在，以及其维持子宫内膜动态平衡和再生的重要作用[14]。寻找上皮和间质来源的干/祖细胞的相关研究已经揭示了人类子宫内膜干细胞的存在，且通过标记滞留法及侧群法已经成功分离出具有特定标记物的子宫内膜干细胞[15]。子宫内膜修复的过程极其复杂，包括炎症反应、血管重建、组织再生和重塑。自体子宫内膜干细胞通过子宫螺旋动脉周围微环境参与子宫内膜修复过程，且在细胞增殖及凋亡这个平衡中起着重要作用，从而维持内膜的分化和自我更新[16]。很多细胞因子及相关成分参与了协调子宫内膜干细胞发挥作用，例如分泌因子(趋化因子、生长因子受体、激素)、细胞外间质(ECM，如纤维连接蛋白、胶原蛋白)，亦包括一些相关物理因子及炎症、瘢痕、富含激素的环境等[17]。

羊膜来源于人胎盘，是一种由滋养层细胞分化而成的低抗原性、富含间充质干细胞的半透明生物薄膜，能够同时达到降低粘连和促进内膜修复的作用[18]。冻干羊膜更适合临床随时备用，其含有丰富的胶原蛋白和蛋白多糖，可增加羊膜抗拉能力，置入宫腔内可与子宫壁紧密贴合，起到屏障作用和基底膜作用，为细胞生长提供足够的三维空间结构，同时能促进上皮细胞增殖分化，加速受损子宫内膜愈合和生长，预防宫腔粘连复发[19]。

研究表明，虽然子宫内膜存在干细胞，但是深入子宫基底层的损伤会引起干细胞的丢失或功能异常，导致子宫内膜再生失败[20]。单纯应用羊膜或其它宫腔支架效果欠佳，而子宫内膜干细胞宫腔注射后很难在损伤局部定位，影响疗效，故去细胞羊膜载体复合自体子宫内膜干细胞用于宫腔粘连的治疗开拓了新的治疗思路，可望克服如上不足。目前，去细胞羊膜载体复合自体子宫内膜干细胞应用于宫腔粘连的治疗尚未见报道。本文此例重度宫腔粘连患者通过宫腔镜分离粘连的宫腔，使宫腔形态大致正常后，用去细胞羊膜载体复合自体子宫内膜干细胞法治疗，有效修复了子宫内膜并成功临床妊娠。去细胞羊膜载体复合自体子宫内膜干细胞法利用羊膜的生物屏障作用阻止宫腔粘连的复发，其丰富的细胞因子、胶原蛋白等物质又可促进子宫内膜修复，同时干细胞以羊膜为支架充分爬行到子宫腔各处，分化为子宫内膜各种细胞成分，通过自分泌或旁分泌等作用重建子宫内膜。此应用可作为修复受损子宫内膜的新思路，为宫腔粘连同时存在子宫内膜过薄、缺失的患者带来了新希望。但是目前干细胞及人羊膜在子宫内膜修复方面的研究尚处在初步阶段，缺乏大样本数据，导致目前尚没有标准化的干细胞治疗方案，需要更多的深入研究来探索其对子宫内膜修复的机制及应用效果，制定出有效的治疗途径和用量，甚至更精准地分离出有效的细胞因子，更有效地修复子宫内膜并预防宫腔粘连的复发。