人类血小板抗体在不同年龄性别儿童免疫性血小板减少症中的表达及其治疗中的意义

张刘仟，朱从奎，尤建国，顾小文

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)为儿童常见临床出血性疾病，在儿童出血性疾病中占1/4，以血小板数量减少、束臂试验阳性、皮肤黏膜自发性出血、延长出血时间和血块收缩不良为主要临床表现。ITP为一种自限性疾病，以维持血小板数量处于安全水平为主要治疗目的，主要为避免严重出血的发生。有学者报道，血小板计数≤30×109/L为界为初始指征是可行的，首先进行观察再治疗并不会对早期疗效减弱，也不会使严重脏器出血等情况出现[1]。研究还报道，ITP患者与健康儿童比较其体内血小板抗体水平呈明显升高趋势，具有一定ITP临床诊断价值[2]。目前对于血小板抗体增高程度和其在ITP患者治疗的临床意义尚未发现较多报道，基于此，本研究病历汇总了人类血小板抗体(human platelet antibody，HPA)与治疗短期有效率之间的这个方面，主要对HPA阳性率、不同性别、年龄与ITP短期有效率关系进行了分析探讨。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取南京医科大学附属淮安第一医院2019年1-8月确诊的60例原发性ITP并行HPA检测的患者作为研究对象，其中男34例，女26例；年龄1个月～12岁。根据年龄的不同分为<3岁组和≥3岁组(不超过18岁)；根据HPA值的不同分为1∶10组、<1∶10组[HPA(-)组]和>1∶10组[HPA(+)组]，其中，1∶10组30例、<1∶10组22例、>1∶10组8例。纳入标准：ITP患者符合2013年儿童ITP疾病诊治建议[3]：(1)正常血细胞形态，血小板计数<100×109/L；(2)皮肤出现瘀斑、出血点或脏器出血和黏膜等情况；(3)一般脾脏无增大；(4)骨髓中巨核细胞数正常或增加，有成熟障碍；(5)本研究经医学伦理委员会批准，所有患者或家属均自愿签署知情同意书。排除标准：(1)系统性红斑狼疮者；(2)其他自身免疫性疾病者；(3)遗传性血小板减少症或以血小板计数减少为首发表现的再生障碍性贫血者；(4)低增生性白血病者。

1.2 仪器和方法 (1)仪器：取德国欧蒙医学实验诊断股份公司生产的抗血小板抗体检测试剂盒和加样板，采用间接免疫荧光法。试剂盒成分包括阴性对照、阳性对照、生物载片、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液、盖玻片、封片介质、吐温20和羊抗人IgG(异硫氰酸荧光素标记)。其中阴性对照为自身抗体阴性(人源)，阳性对照为抗血小板抗体IgG阳性(人源)。(2)方法：包括制备血小板悬液、标记血小板抗体和显微镜下观察荧光强度。首先取患者1.2～2.0 ml乙二胺四乙酸抗凝血，以800 r/min(离心半径20 cm)离心10 min，之后将富血小板血浆分离，磷酸盐缓冲液、吐温缓冲液按1∶10稀释血浆 。然后加样板反应区中加入稀释30 μl血浆，用加样板凹槽盖入载片覆有生物膜的一面，于18～25 ℃下温育(过程中清洁加样板反应区需滴加25 μl异硫氰酸荧光素标记的抗人球蛋白)，时间为30 min，需避光处理，之后将反应膜片进行冲洗(磷酸盐缓冲液、吐温缓冲液)，需5 min浸泡时间，载片水分用吸水纸吸干，然后充分接触二抗所在反应区，温育30 min，需避光并5 min浸泡处理，将盖玻片和封片介质备好，载片水分用吸水纸吸干，盖玻片嵌入载片。最后显微镜下观察荧光强度，比较阴性和阳性对照结果。

1.3 观察指标与评价标准 分析HPA和年龄、性别及治疗的短期有效率之间的关系。短期有效率[4]按相关标准分完全反应、有效、激素依赖和无效。完全反应为无出血，治疗后血小板计数≥100×109/L；有效为无出血，治疗后血小板计数≥30×109/L，增加2倍基础血小板计数；激素依赖为避免出血，皮质激素连续使用使血小板计数≥30×109/L；无效为有出血，治疗后血小板计数<30×109/L或无法增加2倍基础血小板计数。ITP疗效判断需行2次检测，2次间隔7 d及以上。将疗效分为有效组和无效组，激素依赖和无效为无效组，完全反应和有效为有效组。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件包处理。符合正态分布的计数资料采用率或百分比进行描述，采用卡方检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ITP患者一般情况和不同年龄组的男女比 60例原发性ITP并行HPA检测的患者中男34例(56.67%)，女26例(43.33%)，男女比为1.31∶1.0；年龄1个月～12岁。HPA检测患者中不同年龄阶段的性别比例明显不同(P<0.05)， <3岁组男性占多数，≥3岁组女性占多数。见表1。

表1 ITP患者一般情况和不同年龄组的男女比

注：ITP为免疫性血小板减少症。与<3岁组比较χ2=0.003，aP<0.05

2.2 ITP患者不同性别HPA阳性率比较 不同性别HPA阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 ITP患者不同性别HPA阳性率比较

注：ITP为免疫性血小板减少症,HPA为人类血小板抗体

2.3 ITP患者不同年龄HPA阳性率比较 <3岁组HPA阳性率高于≥3岁组(P<0.05)。见表3。

表3 ITP患者不同年龄HPA阳性率比较

注：ITP为免疫性血小板减少症，HPA为人类血小板抗体。与<3岁组比较aP<0.05

2.4 ITP患者不同HPA组短期有效率比较 HPA<1∶10组、1∶10组和>1∶10组ITP患者短期有效率分别为90.00%、90.90%和100.00%。HPA>1∶10组短期有效率高于HPA<1∶10组和1∶10组，差异有统计学意义(P<0.05)。但HPA<1∶10组和1∶10组ITP患者短期有效率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 ITP患者不同HPA组短期有效率比较

注：ITP为免疫性血小板减少症,HPA为人类血小板抗体。与HPA>1∶10组比较aP<0.05

3 讨论

当机体免疫功能出现紊乱时，可直接破坏血小板导致血小板数量减少，也可以通过抑制骨髓巨核细胞的分化，降低血小板的生成，ITP为部分自限性出血性疾病和自身免疫性疾病。大多数认为血小板生成减少和血小板破坏增加为导致ITP血小板生成减少的主要因素。目前研究发现，免疫反应异常、感染和遗传易感性为ITP主要发生机制[5]。免疫反应异常表现在自然杀伤细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫细胞功能异常、细胞因子和血小板抗体产生异常。之前有研究报道过ITP受感染后体内会有交叉反应性抗血小板自身抗体产生，但尚不完全明确其发生机制[6]。感染作为ITP主要发生机制之一，可致机体抗血小板克隆抗体被感染病原体的交叉抗原反应激活，从而破坏血小板，目前也有免疫接种和手足口病等均可使患儿体内减少血小板数量的相关报道。遗传因素对患儿体内免疫功能异常的研究尚未见相关报道。研究发现，ITP与自身免疫性淋巴细胞增生综合征和普通多变型免疫缺陷病密切相关[7]。另有研究发现，ITP患者体内血小板抗体在一定程度上可影响血小板功能[8]。

本研究结果显示，ITP患者<3岁组男童占多数，其发病率也更高，其中<3岁组和≥3岁组男女比例差异具有统计学意义。研究发现，ITP患者男童占多数，<3岁组男童比例更高[9]。这也与学者研究报道符合[10]。尽管如此，但本研究中，不同性别的ITP患儿HPA阳性率比较无明显差异，说明尽管男性儿童的ITP发生率高，但不影响HPA的阳性率。同时，本研究中对于年龄<3岁组HPA阳性率明显高于≥3岁组，分析原因，<3岁儿童的自身免疫系统发育不够完善，受外来因素影响时更加容易出现免疫功能紊乱的情况，因而年龄<3岁的ITP患儿HPA阳性率明显高于≥3岁儿童[11]。本研究还发现，HPA<1∶10组和1∶10组ITP患者短期有效率比较差异无统计学意义，但HPA>1∶10组短期有效率高于HPA<1∶10组和1∶10组，接近100%。说明HPA阳性率高的患儿给予治疗方案治疗会产生更好的效果和反应。这与相关研究结论存在不同，可能与抗体组成和抗体检测方式有关。目前一致认为，免疫异常明显的患儿其接受治疗方式更有效果，对于免疫应答较弱的患儿可从遗传治疗、基因治疗等方面进行靶向药物治疗。

目前ITP患者主要治疗方式包括免疫球蛋白静脉注射、糖皮质激素大剂量冲击疗法、脾切除或服用血小板生成素等，加上抗感染治疗等对症治疗和基础治疗，这些治疗方式对免疫应答较明显的患儿进行了实际验证。许多专家认为，遗传治疗和基因治疗为前沿靶向治疗，可作为研究的重点和热点。希望将来有更好的治疗方式惠及ITP患者。

综上所述，ITP患者<3岁组男性占多数，其HPA阳性率更高。同时HPA检测在一定程度上能指导ITP诊断，HPA>1∶10组在临床上短期有效率更高。