红景天提取物对慢性束缚应激所致大鼠焦虑障碍的作用

王也夫，王玉花，吴桐，李平，崔光成

（1.新乡医学院研究生院，河南 新乡 453003；2.齐齐哈尔医学院精神卫生学院精神药理学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

焦虑障碍是临床最常见的精神障碍之一［1］，其发病机制复杂，受先天遗传和后天环境应激的影响［2］。近年来，关于焦虑障碍生物学机制的探讨逐渐从中枢γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）系统和单胺类系统为主的研究转向为谷氨酸（glutamate，Glu）系统和参与神经可塑性改变的神经肽类的研究［3］。目前，临床上治疗焦虑障碍的药物大多以GABA理论和单胺类假设为基础，虽有一定的疗效，但常出现药物耐受和严重的不良反应，因此，急需研发疗效好、不良反应少的抗焦虑药［4］。红景天为补气清肺、益智养心的传统藏药，具有神经营养和保护作用，其机制与调节海马Glu功能和促进神经再生相关，有文献［5］报道红景天可改善小鼠焦虑样行为。因此，本研究拟观察红景天对大鼠束缚应激所致焦虑样行为的作用，并以海马Glu系统和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）为靶点探讨红景天抗焦虑作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取40只同批次健康标准清洁级雄性SD大鼠，体质量180～190 g，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供［实验动物使用许可证：SYXK（黑）2016-001］。将大鼠按随机数字法分为非束缚对照组（Con组）、束缚模型组（Res组）、红景天低剂量治疗组（Res/Low组）、红景天高剂量治疗组（Res/High组）和红景天高剂量对照组（Hig组）5组。

1.2 试剂

红景天提取物（Rhodiola rosea L.extracts，RhrLE）（红景天苷含量20%）购自西安百川生物科技有限公司；Trizol试 剂、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒、TB GreenTMPremix Ex TapTM试剂盒购自日本TaKaRa公司；Glu检测试剂盒（货号A074 50T/48样）购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒（产品编号P0012）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 动物模型制备和分组处理

1.3.1 慢性束缚应激制备焦虑模型：将大鼠放入自制筒长15 cm、内径6 cm并可以调节长度的不锈钢束缚器，每天束缚3 h（11：00至14：00），连续束缚21 d。

1.3.2 分组处理：束缚应激30 min前给予大鼠RhrLE蒸馏水溶液灌胃21 d。Res/Low组给予RhrLE 80 mg/kg，Res/High组和Hig组给予RhrLE 240 mg/kg，Con组与Res组等比例蒸馏水灌胃21 d。Res，Res/Low和Res/High组给予束缚应激，Con与Hig 组不给予束缚处理。足量自由饮食，每3 d记录1次各组大鼠21 d内的体质量与进食量。

1.4 行为学实验

1.4.1 旷场（open field，OF）实验：大鼠OF反应箱规格为50 cm×50 cm×50 cm。测试前，大鼠在昏暗的房间里适应30 min，实验前擦拭活动箱内壁。测试时，将大鼠轻放于活动箱中央，允许其在箱内自由探索活动10 min。利用检测系统自动记录大鼠的位置和活动情况、中央活动区域路程与区域停留时间以及总路程和总时间。

1.4.2 高架十字迷宫（elevated plus maze，EPM）实验：迷宫由2个交叉的张开的双臂和2个封闭的双臂组成。四臂交叉的中间位置定义为中心区域。实验前30 min将动物转入实验室，当实验开始时将大鼠面对开放臂轻轻放入，允许其在迷宫中自由探索5 min，摄像机记录整个实验过程。分析大鼠进入开放臂和闭臂的次数和时间。

1.5 大鼠海马组织Glu含量的检测

行为学实验完成后，处死大鼠，冰面取脑，分离双侧海马，液氮速冻后置-80 ℃保存备用。取大鼠一侧海马组织，称质量后，加入RIPA裂解液并充分匀浆，12 000 r/min、4℃离心10 min，取上清液，BCA蛋白定量。按Glu检测试剂盒说明，利用分光光度法检测各组大鼠海马组织Glu含量。

1.6 实时PCR检测大鼠海马组织 BDNF的表达量

取大鼠的另一侧海马，采用Trizol法提取总RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录获得cDNA，用qPCR仪进行扩增（95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环）。PCR反应体系为：TB Green Premix Ex Taq（2×）10 μL、PCR Forward primer和Reverse Primer（10 μmol/L）各0.4 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、DNA模 板 2 μL、ddH2O 6.8 μL。根据2-△△Ct计算反转录产物的相对含量。GAPDH做内参照。引物序列见表1。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 红景天对大鼠体质量和进食的影响

束缚应激后各组大鼠的体质量变化如表2所示，从第12天开始Res组体质量较Con组显著下降（P＜ 0.05），而Res/Low组和Res/High组体质量无明显变化（表2）。如表3所示，束缚应激对大鼠的摄食量未产生明显的影响，同时，高剂量RhrEL也未影响大鼠的摄食量。

表1 实时PCR引物序列Tab.1 qPCR primer sequences

表2 各组大鼠21 d内体质量的增长情况（，g）Tab.2 The growth of rats’ body weight during 21 days（ ，g）

表2 各组大鼠21 d内体质量的增长情况（，g）Tab.2 The growth of rats’ body weight during 21 days（ ，g）

1）P ＜ 0.05 compared with Con group；2）P ＜ 0.05 compared with Res group.

表3 各组大鼠21 d内摄食量的比较（ ，g）Tab.3 The food intake of rats over 21 days（ ，g）

2.2 红景天对束缚应激所致大鼠行为学的影响

与Con组大鼠比较，Res组大鼠在OF中的总活动距离、中央区活动量及逗留时间均明显减少 ［F（4，27）=10.35，P＜ 0.05；F（4，27）=5.87，P＜ 0.05；F（4，27）=10.69，P＜ 0.05］，而Res/Low组和Res/High组以上情况均较 Res组明显改善（均P＜ 0.05）。见表4。

EPM实验中，Res组与Con组比较，大鼠进入开放臂次数百分比明显降低［F（4，27）=5.36，P＜0.05］，而Res/Low组和Res/High组进入开放臂的次数较Res组显著提高（均P＜ 0.05）。与Con组比较，Res组大鼠开放臂停留时间百分比明显降低 ［F（4，27）=49.25，P＜ 0.05］，而Res/Low组和Res/High组在开放臂中的停留时间较Res组显著提高（均P＜ 0.05）且Res/High组在开放臂中的停留时间高于Res/Low组（P＜0.05），提示此效应具有剂量依赖性。见表4。

2.3 红景天对海马区Glu含量的影响

Res组大鼠海马中Glu含量较Con组明显增加 ［F（4，35）=7.99，P＜ 0.05］。而Res/Low组和Res/High组海马中Glu含量较 Res组明显降低（均P＜ 0.05）。见表5。

表4 红景天对各组大鼠行为学的影响（n=7）Tab.4 Effects of RhrLE on ethology of rats in each group（n=7）

表5 红景天对各组大鼠海马区Glu含量和BDNF mRNA表达的影响（n=8）Tab.5 Effects of RhrLE on the glutamate concentration and BDNF mRNA expression in hippocampus of rats in each group（n=8）

2.4 红景天对海马区BDNFmRNA表达水平的影响

实时定量PCR结果显示，Res组大鼠海马中的BDNFmRNA表达水平较Con组明显降低 ［F（4，35）=4.75，P＜ 0.05］，而Res/High组海马中BDNF的表达水平较Res组显著升高（P＜ 0.05）。见表5。

3 讨论

近年来，有学者认为红景天能通过改善中枢神经传递和促进周围神经再生以及调控学习和记忆能力治疗焦虑障碍，且其作用机制与大脑神经递质和肽类的调节密切相关［6］。

本研究中，OF实验结果显示，慢性束缚应激可明显缩短大鼠自发活动总路程，而RhrLE灌胃给药则可有效抑制这种改变，提示红景天能降低慢性应激引起的大鼠对外部环境刺激的异常敏感，减少情景恐惧；红景天还能增加慢性应激大鼠的中央区路程与停留时间，说明红景天有效地缓解了慢性应激引起的大鼠对空旷环境产生的焦虑情绪。EPM实验结果显示，慢性束缚应激减少和缩短了大鼠进入开放臂的次数与停留时间，即引起了大鼠的焦虑，但RhrLE灌胃给药增加了慢性应激大鼠进入开放臂的次数和在开放臂中的停留时间，且高剂量组效果更显著，说明红景天具有抗焦虑作用，且该作用存在剂量依赖性。

体质量减少是焦虑障碍模型大鼠的重要的体征之一［7］。本研究发现，慢性束缚第12天开始，束缚模型组大鼠的体质量与非束缚对照组相比明显减少，但RhrLE灌胃给药有效防止了这种改变。另外，RhrLE灌胃给药并未对大鼠的摄食量产生明显影响，提示RhrLE对体质量的影响与其改善焦虑症状有关。

海马作为边缘系统的重要组成部分，参与焦虑抑郁等情感障碍产生和发展。慢性束缚应激可造成大脑海马的兴奋性神经传递功能的改变，主要表现在Glu浓度改变和Glu受体系统的表达和功能改变［8］。本研究发现慢性束缚模型组大鼠的海马Glu含量明显增加，与GAO等［9］报道的慢性应激引起大鼠海马对Glu释放和利用增强相符。本研究还发现RhrLE有效抑制了慢性应激引起的海马Glu浓度增高。表明慢性束缚应激引起的焦虑样行为与大鼠海马区中Glu神经传递的异常增强密切相关，而RhrLE能通过降低海马区中Glu的含量缓解大鼠焦虑障碍。

Glu传递的神经元长时程增强（long term potentiation，LTP）效应作为恐惧消退习得的神经机制之一，在焦虑症中起着重要作用，说明神经可塑性改变是焦虑障碍产生的神经生物学基础［11］。研究［12］证明，BDNF可影响海马LTP产生，参与神经可塑性改变。研究［13］表明，BDNF在神经系统中的表达水平和焦虑障碍密切相关。本研究结果显示，慢性应激使海马中BDNFmRNA表达显著减少，故推测慢性应激通过此作用扰乱海马区LTP等神经传递可塑性，继而引起焦虑障碍［14］。而给予RhrLE灌胃后，海马中BDNF表达明显增加。此结果与提高BDNF的生物利用度能改善焦虑状态相关报道符合［15-16］。同时也说明慢性应激引起的海马兴奋性神经递质浓度增高影响着BDNF的表达分泌，并通过海马中BDNF表达水平的变化影响和干预Glu的合成和利用［17-18］。RhrLE能改善慢性束缚应激大鼠焦虑症状以及BDNF的表达水平，提示红景天可能是通过BDNF与其受体的结合，改善谷氨酸的传递过程，改善海马中的神经元生长、突触传导与突触的可塑性，从而有效抵抗焦虑症状［19］。

综上所述，RhrLE能显著改善束缚应激大鼠的焦虑样行为，慢性束缚可使大鼠海马组织中Glu浓度增加，BDNFmRNA表达水平降低，而RhrLE能有效地抑制上述改变，提示红景天的抗焦虑作用是通过改善BDNF和Glu神经传递介导的。另外，RhrLE不影响正常大鼠的摄食量和体质量，但却有效改善了束缚应激模型大鼠体质量降低的情况，说明RhrLE改善束缚应激大鼠体质量降低的效果与抵抗焦虑作用相关。