PI3K和VEGF-C在口腔颌面部淋巴管畸形中的表达

宋柏璇，于丽，赵振坤，赵志国，王秋旭

（1.中国医科大学附属盛京医院口腔颌面外科，沈阳 110004；2.辽阳市中心医院口腔科，辽宁 辽阳 111009；3.杭州口腔医院特诊科，杭州 310012；4.中国医科大学附属盛京医院病理科，沈阳 110004）

淋巴管畸形是由淋巴管扩张形成的大小不等的囊腔，其病理性质历来是众多学者的关注热点，其中以畸形和肿瘤学说最具有代表性［1］。前者认为淋巴管畸形是一种发育畸形，由淋巴管先天性发育异常或淋巴管后天受外界刺激扩张而成；后者认为淋巴管畸形是一种良性肿瘤，由淋巴管内皮细胞异常增殖而成。研究［2］发现，淋巴管畸形的淋巴管内皮细胞具有高度增殖潜力，注射到小鼠体内时可形成淋巴管畸形样病变。在国际脉管性疾病研究学会分类中，淋巴管畸形未被认为是肿瘤［3］。研究发现［4-8］，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）介导的PI3K/AKT信号通路及血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）参 与肿瘤淋巴管生成。本研究通过应用免疫组化SP法检测淋巴管畸形组织及正常淋巴组织标本中PI3K和VEGF-C的表达情况，探讨PI3K和VEGF-C在口腔颌面部淋巴管畸形中的表达。

1 材料与方法

1.1 标本来源

淋巴管畸形组织来源于中国医科大学附属盛京医院2009年至2014年间手术治疗的淋巴管畸形患者，共35例，其中以颊部、腮腺、颌颈部多见，占总量的85.71%，均经病理证实为淋巴管畸形。正常淋巴组织从腮腺及颌下腺病变组织中分离而来，共10例，经HE染色后确定为正常淋巴组织。

1.2 方法

兔抗人VEGF-C抗体、兔抗人PI3K p110α抗体，购自武汉博士德有限公司。

将35例淋巴管畸形组织和10例正常淋巴组织于切片机上做4 μm的连续切片。切片用二甲苯脱蜡2次，依次置于95%、80%、70%乙醇中脱苯。采用高压修复抗原。用3%过氧化氢浸泡，以灭活内源性过氧化物酶。加入一抗（兔抗人VEGF-C抗体、兔抗人PI3K p110α抗体）和通用型二抗，在37 ℃水浴箱中孵育，每次孵育后PBS冲洗。二氨基联苯胺显色，苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片，镜检。分别用PBS代替2种一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

免疫组化以细胞质和细胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性表达。按照阳性细胞所占比例分别记1～4分：1分，＜25%；2分，25%～＜50%；3分，50%～＜75%；4分，≥75%。按染色强度分别记0～3分：0分，阴性，不着色；1分，弱阳性，浅棕色；2分，阳性，棕黄色；3分，强阳性，棕褐色。二者相乘，0～1分为阴性，2～12分为阳性。染色结果由2名高年资病理医生独立进行判定。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行分析。PI3K、VEGF-C在淋巴管畸形和正常淋巴组织中阳性表达率的比较采用χ2检验；PI3K、VEGF-C在淋巴管畸形中的相关性采用Spearman相关分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组化结果表明，PI3K、VEGF-C位于细胞质及细胞膜中，在淋巴管畸形组织中高度表达（图1）。

图1 淋巴管畸形组织中PI3K和VEGF-C阳性表达 ×200Fig.1 Positive expression of PI3K and VEGF-C in lymphatic malformations ×200

淋巴管畸形组织中，PI3K的阳性表达率为80.00%（28/35），VEGF-C的阳性表达率为88.57%（31/35）；正常淋巴组织中，PI3K和VEGF-C的阳性表达率均为0%（0/10）。淋巴管畸形组织中PI3K、VEGF-C的阳性表达率明显高于正常淋巴组织（χ2=17.910，P＜ 0.05；χ2=24.487，P＜ 0.05）。

淋巴管畸形组织，PI3K与VEGF-C的阳性表达呈正相关（r=0.495，P＜ 0.05）。

3 讨论

PI3K是一种异二聚体，由PIK3CA基因编码的p110α催化亚基和PI3KR1编码的调节亚基（p85）组成［7］。PI3K介导的PI3K/AKT信号通路是细胞内重要的信号传导通路之一，调控多种细胞活动。PI3K/AKT信号通路是近年来研究的热点通路，在人类多种肿瘤的发生、发展中起着重要作用。研究［6，8-11］还发现，该通路参与肿瘤血管及肿瘤淋巴管生成，促进肿瘤的远处转移。VEGF-C是VEGF家族的重要成员，是重要的淋巴管生成因子之一，在肿瘤组织中高度表达。许多临床研究［12］显示，VEGF-C表达水平与淋巴结转移呈正相关。VEGF-C可与淋巴管内皮细胞上表达的酪氨酸激酶受体VEGFR-3结合，促进淋巴管的增殖，从而诱导肿瘤淋巴管的生成和淋巴转移［7］。

目前关于VEGF-C与肿瘤淋巴管生成及转移的研究较多，而关于PI3K/AKT与肿瘤淋巴管生成及转移的研究较少。近年来研究［11，13］发现，PI3K介导的PI3K/AKT信号通路可被上游分子激活，通过作用下游底物分子促进VEGF-C的表达及分泌。研究［11］发现，纤维蛋白的额外结构域A可能通过PI3K/AKT信号通路上调结直肠癌中VEGF-C的表达，从而诱导肿瘤淋巴管生成。在单侧输尿管梗阻诱导的肾淋巴管生成中，发现巨噬细胞通过C-C基序趋化因子受体2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR2）激活PI3KAKT-mTOR信号传导以介导缺氧诱导因子-1α表达，然后驱动VEGF-C表达以促进淋巴管生成［13］。然而现阶段人们对 PI3K介导的PI3K/AKT信号通路及VEGF-C如何促进肿瘤淋巴管生成及淋巴转移仍存在许多未知，并且两者之间的具体作用机制仍不清楚，期待对该通路进行深入的研究。

本研究从分子水平检测淋巴管畸形和正常淋巴组织中PI3K、VEGF-C表达情况，发现在淋巴管畸形组织及正常淋巴组织中PI3K、VEGF-C阳性表达存在显著差异，提示PI3K、VEGF-C与淋巴管畸形内皮细胞增殖有关。淋巴管畸形组织中，PI3K、VEGF-C阳性表达存在相关性，提示在淋巴管畸形中PI3K 介导PI3K/AKT 信号通路被上游分子激活，通过下游分子作用促进 VEGF-C 表达及分泌，共同参与淋巴管畸形的发生及发展。本研究表明，PI3K和VEGF-C的异常表达可能与淋巴管畸形的发生、发展有关，可作为淋巴管畸形病因学研究的指标之一。

迄今为止，淋巴管畸形的发病机制及病理性质尚不明确。临床上可表现为一个孤立的病灶或弥漫性病灶，或作为混合血管病灶的一部分，或作为各种过度生长综合征重要的并发症，常伴有外观及功能的改变。手术及硬化剂治疗可以改善患者的局部症状和外观，但完全缓解较为罕见［14］。目前对淋巴管畸形病因学的研究仍很肤浅，所以，该领域仍存在大量的未知问题有待进一步深入研究和解决。通过对淋巴管畸形发病机制的研究，寻找更好的治疗方法，进而改善患者预后。