miR-625-3p在卵巢浆液性癌中的表达及意义

王莉，蔡旺

（锦州医科大学附属第一医院妇科，辽宁 锦州 121000）

卵巢浆液性癌主要见于中老年人，病变形成后常伴有侵袭和转移，高级别病变患者常伴有对侧卵巢受累，并可见腹腔播散。近年研究［1］认为，浆液性癌的发生与肿瘤间质巨噬细胞的形成及其产生的炎性细胞因子有关。微小RNA（microRNA，miRNA）作为内源性非编码RNA分子，可通过调节基因表达参与肿瘤间质的炎症反应［2］。应用miRbase、Targetscans等数据库预测miR-625-3p的靶基因，可能是调节巨噬细胞形成和炎症反应的因子。本研究分析了miR-625-3p在卵巢浆液性癌中的表达，检测miR-625-3p与巨噬细胞数量及MCP-1的相关性，分析其临床价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2013年1月至2014年2月间在我院诊断为卵巢浆液性癌并行手术根治的67例患者作为观察组，患者年龄49～82（62.8±6.5）岁，中位年龄64岁。纳入患者均经病理医师复审切片，并符合世界卫生组织卵巢浆液性癌的诊断标准，患者术前未行放、化疗。排除内脏器官严重疾病及遗传性疾病、生殖系统手术史及先天发育异常的患者。收集同期我院诊断的60例卵巢浆液性囊腺瘤患者作为对照组，患者年龄43～80（61.7±6.8）岁，中位年龄62岁。均留取新鲜组织-80 ℃冻存，石蜡包埋组织。2组患者一般资料比较无统计学差异。研究经医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 miR-625-3p的检测

应用新鲜冻存组织，试剂盒购自美国Invitrogen公司。操作严格按说明书进行。按照试剂盒说明书提取组织中的总RNA。miR-625-3p引物：上游5’-CT CAAGTCGTAGTCGTCG-3’，下游5’-ACACTAGCTGA GTAGTAGCTT-3’；miR-155引物：上游5’-GCAACAT TCTGAGTAGTCCAGACATC-3’，下游5’-CAGACCAG AGACTCCACCGGTGCTT-3’。PCR程序如下：95 ℃5 min，循环1次；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15个循环；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31个循环。在60 ℃时收集信号，进行实时PCR。记录Ct值，通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。ΔΔCt=［Ct目的基因（未知样品）-CtGAPDH（未知样品）］-［Ct目的基因（校正样品）-CtGAPDH（校正样品）］。

1.3 MCP-1和CD163的免疫组化检测

应用免疫组化SP法检测石蜡包埋组织中MCP-1和CD163的表达。采用苏州睿赢公司的MCP-1和CD163试剂。以50为梯度分组进行预实验染色后，由病理医师对结果进行判读，选择MCP-1为1∶50、CD163为1∶100的显色最佳浓度进行实验。正式实验均由同一操作人员一次完成，DAB显色，严格按说明书进行操作，做好质控工作。结果判定：MCP-1的阳性部位是肿瘤细胞的细胞质。按二维角度进行评分。着色强度：无、弱、中、强分别计为0、1、2、3分；阳性率：随机选择2个400倍显微镜下的视野，阳性率≤5%、＞5%～10%、＞10%～30%、＞30%～50%、＞50%分别计为0、1、2、3、4分。二者相加为总分，阴性标准为≤3分，阳性标准为＞3分。CD163的阳性部位是肿瘤间质的巨噬细胞，选择3个热点区，计数巨噬细胞的数量，取平均值。

1.4 Western blotting法检测MCP-1和CD163的表达

应用术后留取的新鲜冻存组织，检测MCP-1和CD163蛋白的半定量表达。GAPDH为内参。取样本加裂解液后，离心，取上清液提取蛋白，用BCA法测定蛋白浓度；放入100 ℃水浴锅内煮5 min，配制10%SDA-PAG凝胶，加适量蛋白和Loading Buffer混合液，电泳，之后将MCP-1、CD163和GAPDH的胶段切下转移到PVDF膜上，封闭60 min，加入20 mL抗体（MCP-1和CD163均为1∶1 500）和20 mL一抗稀释液，4 ℃过夜，次日洗膜，加入二抗，室温1 h后洗膜，用ECL发光液进行显影。应用ImageJ软件进行灰度分析，对蛋白与GAPDH的比值进行分析。

1.5 统计学分析

采用SAS 6.12软件进行数据分析，行χ2检验、t检验、Pearson相关分析、Kaplan-Meier生存分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 2组miR-625-3p表达的比较

观察组miR-625-3p表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1、图1。

2.2 2组MCP-1阳性率和巨噬细胞数量的比较

观察组中MCP-1阳性率和巨噬细胞数量明显高于对照组（P＜ 0.05）。见表1、图2、图3。

2.3 2组MCP-1和CD163半定量表达的比较

观察组中MCP-1和CD163的半定量表达明显高于对照组（P＜ 0.05）。见表1、图4。

2.4 观察组中miR-625-3p表达、MCP-1和CD163半定量表达与临床病理特征的关系

观察组中，在不同肿瘤最大径、病变级别、脉管癌栓、淋巴结转移、TNM分期中，miR-625-3p表达、MCP-1和CD163半定量表达的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.5 观察组中miR-625-3p表达、MCP-1和CD163半定量表达与增殖指数的关系

表1 2组miR-625-3p表达、MCP-1阳性率、巨噬细胞数量、MCP-1及CD163半定量表达的比较Tab.1 Comparison of miR-625-3p expression，MCP-1 positive rate，macrophage number，and semiquantitative expression of MCP-1 and CD163 between the observation and control groups

图1 miR-625-3p表达的循环曲线图Fig.1 Cyclic graph of miR-625-3p expression

图2 2组中MCP-1的表达 ×200Fig.2 MCP-1 expression in two groups ×200

图3 CD163标记的肿瘤间质巨噬细胞 ×200Fig.3 CD163-labeled macrophages in tumor stroma ×200

图4 Western blotting检测2组中MCP-1和CD163的表达Fig.4 Expression of MCP-1 and CD163 detected by Western blotting in two groups

在高倍镜下（×400）根据切片大小选择 10 个高倍视野（包括阳性细胞最多区域），计算Ki-67 染色阳性细胞占计数总细胞的百分数，取其平均值作为Ki-67 的阳性率。Ki-67阳性表达主要位于细胞核中，染色呈棕黄色。见图5。Pearson相关分析显示，观察组中miR-625-3p的表达与增殖指数呈正相关（r=0.42，P=0.021 5），MCP-1、CD163与增殖指数无明显相关性（P＞ 0.05）。

2.6 观察组中miR-625-3p、MCP-1和CD163之间的相关性

Pearson相关分析显示，观察组中miR-625-3p与MCP-1（r=0.45，P=0.013 2）、CD163（r=0.46，P=0.031 4）的表达呈正相关。

2.7 观察组中miR-625-3p表达的生存分析

观察组患者随访的终点时间为2019年3月31日，失访11例。随访生存时间为11～60（35.7±11.9）个月。生存分析结果显示，miR-625-3p与生存时间有关（P＜ 0.05），miR-625-3p高表达则生存时间短，预后差。见图6。

3 讨论

70%的卵巢浆液性癌患者就诊时已经是晚期，且多数已经在盆腔和腹腔内广泛转移。病变的形成与上皮细胞的异型增生有关。肿瘤分为低级别和高级别病变，均可以对周围组织形成浸润，并形成组织的破坏［3］。部分病例呈弥漫性生长，细胞间连接松散，细胞体积小，易于迁移。研究发现，肿瘤细胞和间质细胞之间的微环境对肿瘤的进展是非常重要的。间质中的浸润细胞主要包括巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等［4］。在肿瘤中，特殊的炎症-免疫细胞（如巨噬细胞和肥大细胞）与预后不良有关，肿瘤相关的巨噬细胞分泌的MCP-1与肿瘤进展有关［5］。miR-625-3p可能有类似癌基因样的作用，能促进肿瘤的形成，使细胞停滞于幼稚阶段，具有“永生化”的DNA遗传特征［6］。研究［7-8］发现，miR-625-3p的功能是阻止细胞的分化，使细胞具有高增殖属性，异型性明显，细胞核的染色深，细胞连接不紧密。RASMUSSEN等［9］通过观察miR-625-3p在结直肠腺癌中的表达，发现其高表达与一线化疗应用奥沙利铂的敏感性有关。也有报道认为miR-625-3p是一种有价值的预测化疗敏感性的指标。p38和MAPK激活因子MAP2K6是miR-625-3p的直接靶标，通过siRNA和化学抑制剂减少p38信号，诱导对奥沙利铂的抗药性［10］。因此，其临床意义可能更广泛。

表2 观察组中miR-625-3p表达、MCP-1和CD163半定量表达与各临床病理特征的关系Tab.2 Relationships between expressions of miR-625-3p，MCP-1，and CD163 and the clinicopathological features of the observation group

图5 卵巢浆液性癌中Ki-67阳性表达 ×400Fig.5 Positive expression of Ki-67 in ovarian serous carcinoma×200

图6 观察组中miR-625-3p表达的生存分析Fig.6 Survival analysis of miR-625-3p expression in the observation group

本研究结果显示，miR-625-3p在肿瘤中的表达升高，提示miR-625-3p是肿瘤形成的重要因素。观察组中miR-625-3p、MCP-1的表达与不同肿瘤最大径有关，提示二者高表达时可以促进肿瘤的生长及局部侵袭。二者与病变级别、脉管癌栓、淋巴结转移和TNM分期的关联性提示，miR-625-3p、MCP-1均是肿瘤进展的重要因素，由于以上因素均为临床判断肿瘤生物学行为的重要指标，因此二者高表达状态提示肿瘤不良的生物学行为。结果显示，卵巢浆液性癌中miR-625-3p的表达与病变的增殖指数密切相关，提示miR-625-3p表达上调后可以引起肿瘤细胞的失控性增生，细胞呈倍数扩增，细胞繁殖明显，细胞生长活跃，肿瘤生长快［11-12］。miR-625-3p对肿瘤细胞的脉管播散和促进淋巴转移有一定作用［13-14］。生存分析显示，miR-625-3p的表达可能对临床判定预后有一定价值，提示对病变组织积极检测miR-625-3p的表达，临床意义明显，即miR-625-3p高表达时患者的预后较差，反之预后较好，其临界值有待更多学者通过大样本研究确定。miR-625-3p在肿瘤细胞中高表达，在细胞形成过程表现出不同的形态，幼稚的上皮细胞成分多，相似于起源组织，细胞生长活跃［15-16］。miR-625-3p对肿瘤进展过程中的间质反应也有一定作用［17］。miR-625-3p与巨噬细胞的关系可能也是miR-625-3p对间质调节作用的一部分，继而分泌MPC-1增多，伴有肿瘤间质的炎症形成，加速肿瘤进展。

综上所述，卵巢浆液性癌中miR-625-3p高表达，对病变的形成有促进作用，miR-625-3p可能对调控细胞增殖有一定影响。miR-625-3p与MCP-1、CD163的表达均呈正相关。术后检测miR-625-3p的表达可能对判断预后有一定价值。