CpG ODN重组质粒对猪外周血淋巴细胞免疫刺激作用的研究

张进进，伭 婷，夏 辉，盛陈艳，麻宝艺，马青霞，刘雅馨，高沙沙，杜 锐，冷 雪*，周 宇

(1.吉林农业大学中药材学院，长春130118； 2. 吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118，3. 惠州海关，广东惠州 516006)

近年来发现的宿主细胞受体和先天免疫反应激活中的“危险信号”(存在于细菌、病毒和真菌中)的作用改变了我们对免疫学的理解[1]，在已知的激活机体先天免疫反应的Toll样受体(TLR)中，Toll样受体9(TLR9)能够识别细菌和病毒DNA中的非甲基化寡聚核苷酸(CpG ODN)基序，并通过诱导炎性细胞因子和I型干扰素(IFN)产生以Th1型为主的免疫应答和CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答[2]。与细菌或病毒DNA相似，人们发现合成的CpG ODN能够模拟天然CpG ODN的免疫刺激活性，诱导B细胞和浆细胞样树突状细胞的增殖，分泌多种细胞因子、趋化因子和IgM[3-4]，从而激活人类、灵长类动物和其他动物的先天性免疫系统[5]。不同种类动物的TLR 9不同，与CpG ODN(A、B、C、P型CpG ODN)作用后诱导的信号通路有所差异，因此，CpG ODN发挥免疫活性具有种属特异性。Kamstrup等研究表明，使用同样的CpG ODN可以诱导猪外周血单个核细胞(PBMC)中IL-6和IL-12的表达和增殖[6]，但在小鼠实验中未观察到这种刺激作用[7]。诸多研究表明，CpG ODN在猪传染性疾病的预防和治疗方面具有潜力[8]。本研究对筛选构建的CpG重组质粒对猪PBMC的免疫刺激活性进行研究，为新型猪用疫苗分子佐剂的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 IMDM细胞培养液购自Gibco公司(批号：1967339)；胎牛血清(批号：TBD31HB)和猪外周血淋巴细胞分离液KIT(批号：LDS1108)均购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；ConA购自上海研生实业有限公司(批号：122H035)；MTS购自Promega公司(批号：313575)；质粒提取试剂盒购自Axygen公司(批号：16018KA1)；猪IL-4 ELISA检测试剂盒(批号：20190716)和猪IFN-γ ELISA检测试剂盒(批号：20190716)均购自北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶EocRⅠ(批号：K2602AA)和Hind Ⅲ(批号：AH50858A)均购自TaKaRa公司。

1.2 试验方法

1.2.1 CpG ODN的设计与合成 根据对猪和人具有较好刺激活性的CpG基序ATCGAT、GTCGTT和GACGTT，设计并合成11条包含CpG单元的序列，其中，GC-ODN为不含CpG基序的阴性序列，全部CpG ODN的核酸骨架进行硫代修饰，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 CpG ODNs序列

1.2.2 猪PBMC的分离和培养 用75%酒精消毒4～6周龄健康未接种疫苗猪颈部皮肤，固定后从前腔静脉无菌采血，用含肝素的无菌真空采血管收集血液。按照猪外周血单个核细胞分离液试剂盒使用说明，分离获得猪PBMC。以1 mL的含10%胎牛血清IMDM营养液重悬细胞，取90 μL重悬所得的细胞并加入10 μL台盼蓝染色液，轻轻混匀，染色3 min；吸取少量经过染色的细胞，在倒置显微镜下观察并计算细胞数待用。

1.2.3 不同序列的CpG ODN刺激猪PBMC增殖能力检测 使用含10%胎牛血清的IMDM营养液将猪PBMC浓度调至1×106/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL。分别加入阴性对照GC-ODN和设计合成的11条CpG ODN序列，CpG ODN的终浓度为5 μg/mL；阳性对照孔加入ConA溶液，加入终浓度为5 μg/mL；空白组加入与CpG ODN等体积的PBS，每组3个复孔。将96孔细胞培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养32 h，培养结束前4 h，每孔加入20 μL MTS溶液，培养结束后立即用酶标仪检测各孔在490 nm波长的OD值，并计算刺激指数(SI值)，SI值计算公式如下：SI=(OD样品-OD空白)/(OD阴性-OD空白)。

1.2.4 含CpG基序重组质粒的合成和鉴定 以1.2.3项中筛选出的对猪PBMC具有较好刺激活性的CpG序列为核心，设计含6次重复的CpG序列，并在其两侧分别加入HindⅢ和EcoR I酶切位点，两端含有酶切位点的双链CpG ODN由宝生物(大连)有限公司合成并克隆入pUC19载体中，对获得的重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定。

1.2.5 重组质粒刺激猪PBMC增殖能力检测 将提取的CpG ODN重组质粒接种于含猪PBMC的96孔板，PBMC浓度为1×106/mL，每孔100 μL。质粒终浓度分别为1、2.5、5和10 μg/mL，同时设阴性对照和空白对照，阳性对照孔加入5 μg/mL ConA溶液。按照1.2.3项中方法测定各孔在490 nm波长的OD值，并计算SI值。

1.2.6 细胞因子IL-4和IFN-γ检测 将猪PBMC浓度调至1×106/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL。将CpG ODN重组质粒分别加入96孔细胞培养板，质粒终浓度为5 μg/mL，空白组加入PBS，同时设不含CpG基序的质粒作为对照，每个样品设3个重复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。每孔收集上清100 μL，按照猪IL-4 和IFN-γ ELISA检测试剂盒说明书的操作步骤进行，根据标准曲线确定所测细胞因子的浓度。

1.2.7 统计学分析 应用SPSS11.0软件进行统计学分析，实验结果以平均值±标准差表示，组间均数比较采用完全随机试验方差分析的方法，检验水准α=0.05。

2 结果与分析

2.1 不同序列CpG ODN刺激猪PBMC增殖能力检测 结果见表2。使用不同序列CpG ODN刺激猪PBMC，除CpG04外，其他CpG ODN的SI值均大于2，其中CpG06、CpG07和CpG08的SI值分别为5.82、5.27和5.58，对猪PBMC具有较好的刺激活性。

表2 不同序列CpG ODN对猪PBMC刺激效果

2.2 CpG ODN重组质粒酶切鉴定 以对猪PBMC具有较好刺激活性的CpG06和CpG08为核心，经6次重复，两端分别加入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，合成并构建获得重组质粒pCpG06和pCpG08。对获得的重组质粒经酶切鉴定(图1)，结果分别获得约181 bp和158 bp的目的片段，与预期大小相符，构建的重组质粒经进一步测序鉴定证明构建正确。

M.Marker DL2000；1.pCpG06 Hind Ⅲ单酶切；2.pCpG06 EcoRI单酶切；3.pCpG06 Hind Ⅲ和EcoR I双酶切；4.pCpG08 Hind Ⅲ单酶切；5.pCpG08 EcoR I单酶切；6.pCpG08 Hind Ⅲ和EcoR I双酶切M.Marker DL2000；1.Enzyme digestion of pCpG06 by Hind Ⅲ；2.Enzyme digestion of pCpG06 by EcoR I；3.Enzyme digestion of pCpG06 by Hind Ⅲ and EcoR I；4.Enzyme digestion of pCpG08 by Hind Ⅲ；5.Enzyme digestion of pCpG08 by EcoR I；6.Enzyme digestion of pCpG08 by Hind Ⅲ and EcoR I

2.3 CpG ODN重组质粒刺激猪PBMC增殖能力检测 结果见表3。重组质粒pCpG06和pCpG08接种猪PBMC后测得其SI值均大于2，且SI值随质粒浓度的增加而升高。当质粒浓度为5 μg/mL以上时，重组质粒pCpG06和pCpG08的SI值分别大于4和5，表明构建的重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC具有较好的刺激活性。

表3 不同浓度CpG 重组质粒对猪PBMC刺激效果

“-”：Blank control without SI value

2.4 细胞因子IL-4和IFN-γ检测 用pCpG06和pCpG08重组质粒分别刺激猪PBMC 24 h后，收集上清，检测上清中IL-4和IFN-γ含量。图2结果表明，pCpG06和pCpG08重组质粒能够促进猪PBMC高分泌细胞因子IL-4，而对IFN-γ的分泌没有明显影响。

图2 CpG重组质粒刺激猪PBMC后IL-4和IFN-γ分泌水平

3 讨论和结论

在佐剂的研究中，人们逐渐认识到固有免疫对获得性免疫的促进作用。CpG ODN是TLR9的激动剂，能刺激人及哺乳动物的天然免疫应答，在作为疫苗佐剂、抗病毒及抗肿瘤方面显示出应用前景。小鼠体内研究中已证实，CpG ODN能通过激活免疫反应抵抗广泛的病毒和其他微生物，如HBV、HIV、HSV、李斯特菌等的感染。Coley公司开发的C型CpG ODN 10101具有剂量依赖性地降低HCV感染者血中病毒RNA水平的作用，患者耐受性良好[9]。CpG ODN 7909用作乙肝疫苗佐剂的临床试验显示，接种疫苗和7909混合物的受试者血清中抗原特异性的抗体出现更早，滴度更高[10]。我国朱鸿飞等将设计合成的CpG序列与pUC18载体链接，获得的重组质粒与猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)活疫苗联合使用，能够有效提高PRRS特异性抗体和细胞因子水平，提高疫苗的免疫保护效果[8]。

CpG ODN能以TLR9依赖的方式刺激机体的固有免疫应答，通常用于TLR9应答研究[11]。 已有报道表明，用不同CpG ODNs体外刺激3种猪源细胞，都能够使猪源细胞TLR9相关信号通路分子的转录水平升高，分别可作为潜在的猪Th1/Th2、Th1和Th2型免疫反应特异性诱生剂促进不同类型细胞因子的表达[12]。本研究根据对猪和人具有较好刺激活性的CpG基序ATCGAT、GTCGTT和GACGTT，设计并合成11条CpG序列，除CpG04外，其他CpG ODN的SI值均大于2。其中CpG06和CpG08的SI值最高，分别为5.82和5.58，对猪PBMC具有较好的刺激活性。以CpG06和CpG08为核心基序，分别合成6次重复序列，并连接入pUC19载体，获得的重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC均具有较好的刺激活性，SI值分别可达4.97和5.32。同时能够刺激猪PBMC产生较高水平的IL-4，而对IFN-γ的产生无明显刺激活性，这与部分CpG对免疫活性细胞的刺激作用研究结果一致[13]，而针对于其他细胞因子的促进作用仍有待于进一步研究，进而确定其所适用的疫苗类型。

总之，本研究获得的含CpG基序重组质粒pCpG06和pCpG08对猪PBMC具有较好的刺激活性，并可刺激猪PBMC产生较高水平的IL-4，为CpG重组质粒作为疫苗佐剂的研究奠定了试验基础。