2019年我国部分地区鸭圆环病毒基因序列测定与分析研究

卢秀娴，张思远*， 梁昭平， 林举攀，云骜，叶贺佳

(1.广州市华南农大生物药品有限公司，广州，510300 2.华南农业大学，广州，510642)

鸭圆环病毒(Duck circovirus，DuCV)属于圆环病毒科圆环病毒属的成员之一，是一类无囊膜、二十面体对称的单链环状最小的DNA病毒[1]，该病毒目前还不能直接进行体外分离培养，主要侵害动物免疫系统并造成免疫抑制，各日龄、品种的鸭均易感[2]，临床症状表现为羽毛紊乱、生长迟缓、体况消瘦等[3]，该病毒感染后容易导致其他禽类疾病的并发或继发感染，从而给养鸭业造成严重的经济损失。

DuCV是近年来新发现畜禽病毒之一，最早于2003年由德国学者Hatterman[4]从番鸭的法氏囊组织中研究发现；2008年傅光华等首次在我国大陆地区成功克隆了鸭圆环病毒的全基因序列[5]，此后，在国内各地区鸭群中陆续检测到DuCV的感染[6]，混合感染病例增多，近年来已经在我国大部分地区广泛流行。

为进一步了解鸭圆环病毒在我国部分地区的感染与流行情况，了解其分子生物学特性，通过对山东、河南、江苏、安徽等地区30份鸭圆环病毒感染的阳性病料进行鸭圆环病毒的全基因组的克隆和序列测定，对毒株的核苷酸分子特点进行分析，以期了解国内部分地区 DuCV 的流行毒株的基因型及遗传变异情况，为鸭圆环病毒感染的防控和诊断提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2019年1月至6月，从山东、河南、江苏等省份发病鸭场采集疑似鸭圆环病毒感染的病料30份，其发病鸭出现羽毛脱落，生长迟缓等症状，剖检可见肝脏肿大，脾肿大充血、有坏死灶等。采集肝、脾、等内脏组织，-20℃保存，经华南生物动物疫病诊断中心PCR检测均为DuCV阳性样品。

1.1.2 试剂 DNA提取试剂盒(9781)、pMD19-T载体(6013)、DL2000 DNA Marker(3427A)购自TaKaRa公司、TransStart KD Plus DNA Poiymerase(AP301-11)、购自北京全式金公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP103)、核酸染料(KP103)为天根公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料的处理及DNA的提取 将病料组织剪碎，在研钵研磨成糊状，按1∶5-10的比例加入灭菌PBS，反复冻融三次，7000～8000 rpm/min离心10～15 min，取上清液用TaKaRa核酸抽提试剂盒抽提基因组DNA。

1.2.2 引物设计与合成 参照 Genbank中登录的鸭圆环病毒基因组序列，设计合成了2对扩增产物首尾相连且相互重叠的引物，用于鸭圆环病毒全基因组核苷酸的扩增，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成见表1。

表1 DuCV全基因组扩增引物序列

1.2.3 鸭圆环病毒基因组全长的PCR扩增与序列测定 以上提取的DNA为模板，用以上2对引物分别进行PCR 扩增，PCR程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共34个循环。扩增完成后，两者PCR 产物取5 μL经1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果，PCR产物经胶回收，连接到 pMD19-T载体，转化宿主菌DH5α感受态细胞，经培养筛选，挑取单个转化菌落于LB培养液 (Amp+)过夜培养，PCR鉴定阳性克隆菌送至上海金唯智股份有限公司进行测序。测序结果用DNAStar，进行拼接分析。

1.2.4 DuCV全基因组序列分析 运用DNAStar和MEGA7.0将获得的DuCV全基因序列，与GenBank参考株基因组序列比对，进行同源性比较和基因进化树分析。本研究用于核酸序列分析参考的毒株(表2)。

表2 用于序列分析和比较的参考毒株信息

1.2.5 鸭圆环病毒Cap和Rep蛋白氨基酸序列分析 采用DNAMEND软件预测和分析30株DuCV 的Cap蛋白抗原位点的分布情况，采用NetNG-Lyc1.0在线软件和NetPhos 2.0软件预测和分析Cap蛋白N-糖基化位点。

2 结 果

2.1 鸭圆环病毒全长基因组测序结果 测序结果通过应用DNAStar软件中的SeqMan对序列进行拼接，获得30株DuCV的全基因序列。鸭病毒基因组为环形，基因组包含4个200 bp以上的ORF，即V1(49～927 bp)、C1(1157～1930 bp)、C2(1377～1739 bp)、C3(164～400 bp)，但大多数DuCV只有2个主要的阅读框ORF V1和ORF C1，分别编码与病毒复制有关的Rep蛋白和核衣壳蛋白Cap 蛋白，ORF C3为新发现的可编码引起机体的淋己损伤及细胞润亡的阅读框。26株DuCV的全基因序列长为1993～1995 bp，4株DuCV的全基因序列仅有1988 bp，缺失了ORF C2、ORF C3。全基因组序列存在2个与滚环复制相关的保守区域，还存在可启动滚环复制过程中酶促反应的dNTP结合域。

2.2 鸭圆环病毒基因同源性分析 使用DNAStar软件MegAlign对30株DuCV 基因核苷酸和氨基酸序列进行分析，毒株之间的核苷酸和氨基酸序列同源性为85.8%～99.9%，30株与其他国内外不同时间的DuCV参考毒株的全基因组序列的同源性为 83%～99.3%，与2010年之后的DuCV参考毒株同源性较高，达90%以上；26株DuCV与MH25株和YS07株等中国大陆毒株的同源性最高，核苷酸序列同源性大于96%；4株DuCV与WF0802和TC1/2002等毒株的同源性较高，核苷酸同源性为90%～97.3%左右。将30株DuCV 全基因序列与圆环病毒科中其他动物圆环病毒基因组序列进行比对发现，从不同动物中分离得到的圆环病毒, 其同源性差异比较很大。与鸡圆环病毒(鸡贫血病病毒CIAV)同源性最低，仅为2.4 %，与鹅圆环病毒的同源性在65%左右，与鸽子、猪等圆环病毒的同源性则为22.5 %～ 28.2 %。

2.3 鸭圆环病毒基因组的遗传进化树分析 采用MEGA7.0软件对获得的30株DuCV 全基因序列与参考毒株序列绘制基因遗传进化树，按现行的DuCV分型方法，根据DuCV的Cap蛋白基因在某些区域氨基酸差异较大，并以1988bp作为分界点，DuCV分为1型、2型两个基因型[7]，分别是以德国株为代表的 DuCV-1型和以台湾株为代表的DuCV-2型。本试验获得的30株DuCV序列，其中26株属于DuCV-1型，与YS07株等中国大陆DuCV毒株的遗传距离最近；4株为属于DuCV-2型，则与我国大陆毒株WF080株关系较近；与其他动物圆环病毒处在不同的进化分支上，与鹅圆环病毒的亲缘关系较近，其次是鸽圆环病毒(COCV)，猪圆环病毒(PCV1和PCV2)，而与鸡圆环病毒(鸡贫血病病毒CIAV)遗传距离较远。

2.4 鸭圆环病毒Cap和Rep蛋白氨基酸序列分析 对采用DNAMEND对30株DuCV 各自编码Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列进行分析，与不同时间的DuCV参考毒株比较，Cap蛋白的氨基酸的变化区域集中在：30～64，104～124，233～238，与DuCV基因组划分基因型序列的变异是相同的；Rep蛋白的氨基酸的变化区域则集中在：105～133，200～230，275～285。Cap蛋白构成DuCV的核衣壳，是主要的结构蛋白，存在有抗原位点及糖基化位点，通过对Cap蛋白抗原位点析，发现DuCV-1型的26株DuCV均有8个抗原表位区域，分别位于35～42、64～70、108～116、118～132、139～145、173～189、208～220和243～251；而DuCV2型的的4株DuCV则存在5个抗原表位区域，分别位于31～35、108～134、177～187、208～220、243～251；预测Cap蛋白的糖基化位点的结果与相关研究一致[8]，不同地区与基因型的DuCV分别在第206、211和231位氨基酸处存在N2糖基化位点，大部分DuCV毒株的Cap蛋白氨基酸糖基化位点在第211出现NCT→NCS和231出现NTT→NAT变动。相关研究表明，由于Cap衣壳蛋白存在可变区，即氨基酸序列的差异，用以区分基因组分型，当DuCV-1型和DuCV-2型的抗原表位及糖基化位点的氨基酸序列出现变化时，可能会造成DuCV-1型的抗原性稍强于DuCV-2型的抗原化[9]，其所受到的免疫压力可能更大，其致病性也可能出现差异[10]。

注:▲为本试验分离株

3 讨论与结论

DuCV与其他圆环病毒属成员一样，常常以隐性潜伏感染存在[11]，具有免疫抑制特性和感染的持续性。当病毒入侵机体的免疫系统，导致免疫功能下降，影响机体对其他疫苗的免疫效果，抵抗病原体的能力下降，从而继发感染其他疾病，而一旦发生混合感染，感染鸭的死亡率就会增加，特别是不同地区的DuCV的广泛流行使我国的鸭圆环病毒疫情变得更加复杂，防控难度增大。

30株DuCV全基因序列分析结果显示，26株DuCV的全基因序列长为1993～1995 bp，4株DuCV的全基因序列仅有1988 bp；全基因组序列的5′端均存在DuCV基因结构的特征[12]，9个保守碱基组成顶端的茎环结构，下游存在与病毒基因组滚环复制有关的2个正向的6个碱基序列。同源性比较显示，获得的30株DuCV全基因序列之间的同源性为83.7%～99.9%，同一基因型全基因组序列差异较小，而DuCV-1与DuCV-2两个基因型全基因组序列之间差异较大，可达13%～16.3%；与其他国内外不同时间的DuCV参考毒株的全基因组序列的同源性比较，与2010年之后的DuCV参考毒株同源性较高；与圆环病毒科中其他动物圆环病毒基因组同源性差异比较很大。对DuCV流行毒株分子遗传变异情况分析显示，且两个基因型之间差异较显著，在遗传进化上分为两个明显的分支，表明近几年来同时流行了两种基因型的DuCV，在全国各地均有分布，DuCV在同一年代同一区域的分离株之间的相似性比较高，有非常近的遗传距离并聚集成簇，具有趋同进化的倾向；DuCV-1型的流行毒株与不同时间的DuCV参考毒株在遗传进化总体上没有明显的分布地区和流行时间；DuCV-2型流行毒株与参考毒株在系统发育上关系接近却又独立分支，说明DuCV可能存在一定的变异；所有流行毒株与其他动物圆环病毒处在不同的进化分支上，亲缘关系较远。对Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列的变异分析表明Cap蛋白的变异程度要显著高于Rep蛋白，这可能是由于Cap蛋白为病毒最主要的致病性蛋白，需要快速大量的产生变异来保证生存[13]。另外，在长期进化过程中与选择压力下，鸭圆环病毒的分子进化中也容易发生突变。

现有的病毒增殖体系难以增殖DuCV，对于DuCV的研究主要局限在检测和基因组序列分析等方面[14]。对于鸭圆环病毒病在实际工作中主要以预防为主，药物治疗方法效果较差，因此需要从加强鸭群饲养管理和生物安全措施，改善养殖环境，提高鸭群对DuCV的抗病能力，防止继发感染其他疾病。该研究对2019年上半年的DuCV流行毒株进行了遗传变异分析，旨在为研究鸭圆环病毒分子流行病学的流行株和分布情况提供参考依据，为更好地调查和防控该病提供了科学依据。