H4、N2和所有亚型禽流感三重RT-PCR检测方法的建立

罗思思，谢芝勋，李孟，黄娇玲，李丹，谢丽基，张民秀，曾婷婷，王盛，张艳芳，范晴，谢志勤，邓显文

(广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV) 属于正黏病毒科A型流感病毒属，是单股、分节段的RNA病毒，编码8个基因(PB1、PB2、PA、HA、NA、M、NP和NS)。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同，目前已发现18个HA亚型和11个NA亚型[1]。部分H5和H7亚型为高致病性AIV(Highly pathogenic AIV, HPAIV)，可引起家禽大规模死亡，并可传染给人[2]。大多数亚型AIV均为低致病性AIV(Low pathogenic AIV, LPAIV)。

H4亚型AIV属于LPAIV，在流感调查项目中，发现H4亚型AIV常可分离到，已作为常分离出的主要亚型之一[3-5]。N2亚型AIV是最常见的NA亚型。快速检测H4、N2和所有亚型AIV的方法对于AIV的防控具有重要意义。目前，检测AIV的方法多为病毒分离鉴定，结果准确可靠，但存在操作步骤较多、耗时长的缺点，而在实际应用中更需要简单、快速的检测方法。多重PCR是在普通PCR基础上建立起来的，即在同一反应体系中加入多对引物从而实现多个目的基因同时扩增，具有快速、简便、成本低、可同时检测和鉴别多种病原体等特点，已被广泛应用于病原微生物的检测[6-8]。本研究旨在利用多重RT-PCR技术，建立一种特异、敏感、简便和快速检测H4、N2和所有亚型AIV的三重RT-PCR方法。

1 材料与方法

1.1 毒株和主要试剂 不同亚型AIV(H1N1、H1N2、H3N2、H3N6、H3N8、H4N2、H4N6、H5N2、H6N2、H6N6、H7N2、H9N2)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV4)由广西壮族自治区兽医研究所分离保存；AIV毒株的RNA(H5N2、H7N2)由美国康涅狄格州立大学惠赠；传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)、禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)和鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum, MG)购自中国兽医药品监察所。DNA/RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2购自TaKaRa公司；SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。

1.2 引物设计 在GenBank基因库中下载H4亚型AIV HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列，应用DNAstar软件比对序列，找出保守区域。针对保守序列，在Primer Premier 5.0软件掌握序列片段的Tm、错配和二聚体等信息，从而设计和筛选引物，初步筛出的引物经NCBI-BLAST模拟验证特异性，最终得出候选引物，发至广州Invitrogen公司合成。通过实际试验的验证，表1中的3对特异性引物可在同一反应体系混合使用，用于同时检测H4、N2和所有亚型AIV。

1.3 病毒核酸提取与三重RT-PCR反应条件优化参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，抽提病毒RNA或DNA。一步法RT-PCR反应体系25 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，H4、N2和AIV-M 三对引物终浓度在0.1～1 μmol/L之间调整，RNA 2 μL，以无RNA酶的超纯水补足25 μL。反应程序如下：50 ℃ 30 min, 94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s, 50 ℃ ～ 65 ℃之间调整 40 s, 72 ℃ 40 s, 35个循环；72 ℃ 10 min。

表1 引物信息

1.4 三重RT-PCR特异性试验 用该法对H4N2亚型AIV不同分离株、H4Ny(y≠2)亚型AIV (H4N6)、HxN2(x≠4)亚型AIV(H1N2、H3N2、H5N2、H6N2、H7N2、H9N2)、HxNy(x≠4，y≠2)亚型AIV (H1N1、H3N6、H3N8、H6N6)、NDV、IBV、ILTV、ARV、FAdV4、MG的RNA/DNA进行三重RT-PCR检测，检验该法的特异性。

1.5 三重RT-PCR敏感性试验 测定H4N2亚型AIV的RNA浓度，将RNA倍比稀释为6 ng/μL、600 pg/μL、60 pg/μL、6 pg/μL、600 fg/μL、60 fg/μL和6 fg/μL。用该法分别对各浓度RNA进行三重RT-PCR的检测，检验该法的敏感性。

1.6 三重RT-PCR临床样品检测 用该法对从广西南宁市活禽市场采集的185份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测。同时，将棉拭子溶液接种至9～11日龄SPF鸡胚，35 ℃孵育24～120 h进行病毒增殖与分离，收集尿囊液，用血凝试验(HA)对其进行鉴定，对有血凝性的样品进一步用血凝抑制试验(HI)鉴定出H亚型。对已确定H亚型的样品，提取病毒RNA，参照文献[9]的HA和NA基因全长引物，扩增和克隆HA和NA基因并送广州Invitrogen公司测序。

2 结果与分析

2.1 反应条件优化结果 经过对引物之间浓度的优化，H4-F和H4-R引物终浓度为0.6 μmol/L，N2-F和N2-R引物终浓度为0.4 μmol/L，AIV-M-F和AIV-M-R引物终浓度为0.3 μmol/L。退火温度优化结果表明,最佳退火温度为56 ℃。

2.2 特异性结果 图1显示，用该法对H4N2亚型AIV的检测出现3个目的条带，分别为454 bp(H4亚型AIV)、282 bp(N2亚型AIV)和 167 bp(所有亚型AIV通用检测)；对H4Ny(y≠2)亚型AIV (H4N6)检测出现2个目的条带，分别为454 bp和167 bp；对HxN2(x≠4)亚型AIV(H1N2、H3N2、H5N2、H6N2、H7N2和H9N2)的检测出现2个目的条带，分别为282 bp和167 bp；对HxNy(x≠4，y≠2)亚型AIV(H3N6、H3N8、H6N6)的检测只有167 bp目的条带；对常见禽病病原体(NDV、IBV、ILTV、ARV、FAdV4和MG)的检测无扩增条带；结果与实际相符。

M. DL1000 DNA Marker；1-3. H4N2亚型AIV不同分离株；4. H1N1；5. H1N2；6. H3N2；7. H3N6；8. H3N8；9.H4N6；10.H5N2；11. H6N2；12. H6N6；13. H7N2；14. H9N2；15.NDV；16.IBV；17.ILTV；18. ARV；19. FAdV4；20. MG；21. 阴性对照

2.3 敏感性结果 用该法对H4N2亚型AIV不同浓度的RNA进行检测，结果见图2。对6 ng/μL ～6 pg/μL浓度的RNA，H4、N2、AIV-M引物均能检测到；对600 fg/μL浓度的RNA，H4、N2、AIV-M引物均检测不到，无条带。因此，该法至少能检测到6 pg/μL的RNA。

2.4 临床样品检测结果 用所建立的方法对185份临床样品进行检测，结果见表2。有3份样品扩增出3条特异性条带，表明为H4N2亚型AIV；有1份样品扩增出454 bp和167 bp的2条特异性条带，表明为H4亚型AIV；有7份样品扩增出282 bp和167 bp的2条特异性条带，表明为N2亚型AIV；有8份样品均出现167 bp的单一条带，表明为其他亚型AIV(非H4和N2亚型)；其他166份样品均无任何条带，表明不是AIV。上述样品通过病毒分离、血凝抑制试验和进一步测序鉴定，结果与上述相符。

M: DL1000 DNA Marker；1: 6 ng/μL；2: 600 pg/μL；3: 60 pg/μL；4: 6 pg/μL；5: 600 fg/μL；6: 60 fg/μL；7: 阴性对照

表2 临床样品检测结果

3 讨论与结论

H4亚型AIV自1956年首次在捷克从鸭中分离出，之后广泛分布于亚洲、欧洲和北美洲[10-12]。水禽和滨鸟是H4亚型AIV的主要宿主，并可感染海狮、马和猪等哺乳动物[13-14]。在全球流感检测中，H4亚型分离率较高，在野鸟中广泛流行[15]；在我国中部、东部和南部的活禽市场广泛传播，并发现该亚型与其他亚型进行复杂基因重组[3-5]。有研究报道，H4N6和H9N2共感染的家禽可导致高频的基因重组，重组病毒比野生型病毒毒力更强[16]。虽然尚未有H4致死人和导致家禽大规模死亡的案例，但根据流行调查结果，警惕我们需要定期监测该亚型的流行态势和遗传进化情况。H4亚型AIV在流感病毒进化中起的作用不容忽视[17]。N2亚型是主要的NA亚型，常与H1、H3、H4、H6、H9等搭配组合，H4N2是常见的组合。因此，对于目前AIV的防控，建立一种H4、N2和所有亚型AIV的检测方法十分迫切。

本研究成功建立了H4、N2和所有亚型AIV的三重RT-PCR检测方法，关键在于3对特异性引物的设计。分别针对H4、N2亚型AIV的 HA和NA基因保守序列，设计了2对型特异性引物，用于H4、N2亚型AIV的检测；M基因在所有亚型AIV的进化中较为保守，针对M基因设计了1对型通用引物，用于所有亚型AIV的检测。由于3对引物混合在同一反应体系使用，因此在设计引物时需考虑各扩增片段至少相差100 bp，各引物之间无非特异性反应和错配，避免竞争性的扩增。建立的三重RT-PCR方法首先检查是否存在AIV的感染，同时确定是否存在H4、N2亚型的感染；其次，如无H4、N2亚型AIV感染，可确定是否存在其他亚型AIV的感染，为进一步诊断提供参考依据。该法的局限性在于只能判定是否存在H4N2、H4Ny和HxN2亚型AIV的感染，并可辅助确定是否存在其他亚型AIV的感染，但无法确定是否存在混合感染的情况(H4N2与H4Ny、H4N2与HxN2、H4N2与HxNy、H4Ny与HxNy等)。

本研究通过设计和筛选3对特异性引物，优化反应条件，建立同时检测H4、N2和所有亚型AIV的三重RT-PCR方法，具有特异性强、灵敏度高、成本低和省时省力等优点，为有效防控AIV提供技术支撑。