蒙药白花龙胆花总黄酮提取工艺及醇提物的抗炎活性研究

嘎 鲁，格根塔娜，盛 华，王玉华

（内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010011）

白花龙胆花为龙胆科植物高山龙胆（gentiana purdomii Marq.）的干燥花，蒙语名为查干—珠勒根—其木格，别名有邦占嘎日布，那木日音—其其格，查干—邦占（通称）。按花的颜色可分为白、黑、花3种，但白色者为上品[1-2]，主要分布于西藏、青海、新疆、甘肃、四川等地，其味涩、苦，性寒；效软、柔、稀。具有清热解毒，止咳，利咽喉作用，蒙医临床上主要用于治咽喉肿痛，音哑，肺热，毒热等。蒙医药古籍《蒙药验方》中记载查干—珠勒根—其木格在对咽喉病症特效的蒙药复方呼和嘎日迪-13等中均有应用[3]，主要含龙胆碱等生物碱，异荭草素等黄酮类化合物[4-8]。本项目对白花龙胆花总黄酮提取工艺和醇提物体内抗炎活性进行研究，现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 动物 昆明种小鼠（雌雄兼用，19～27 g），由内蒙古大学实验动物中心提供。

1.2 药材及药物 白花龙胆花采自青海省，阿司匹林（石药集团）、二丁颗粒（修正药业）。

1.3 试剂 乙醇（分析纯）、蒸馏水、生理盐水；芦丁标准品（Y-132-150801，含量：98.0%，中国食品药品检定研究院）。

1.4 仪器 分析天平、旋转蒸发仪、超声提取仪、高压灭菌锅、冷冻干燥机、紫外分光光度计。

2 白花龙胆花总黄酮提取工艺试验

2.1 标准品溶液的制备 精密称取芦丁标准品11.55 mg，用乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，摇匀，得浓度为0.23 mg/mL的芦丁标准品溶液。

2.2 线性关系的考察 分别取标准品溶液0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL于6个25 mL容量瓶中，以乙醇溶液作为空白对照，依次加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，摇匀，静止5 min；加10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，静止6 min；加40%氢氧化钠溶液0.5 mL，用乙醇定容，摇匀。在510 nm波长处分别检测吸光度，以标准品溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，得芦丁溶液在0.005 6～0.023 0 mg/mL浓度范围之内线性关系良好。

2.3 单因素实验

2.3.1 乙醇浓度对白花龙胆花总黄酮含量的影响 精密称取白花龙胆花粉末5份，每份约1 g，25℃超声提取2次，提取仪功率220 W，液料比1:30，超声时间30 min，提取溶剂分别为40%、55%、70%、80%、95%乙醇，测定波长为510 nm 处吸光度，40%浓度提取物黏度过高，无法过滤，剩余4组吸光度（A）分别为0.863、0.920、0.841、0.744，总黄酮含量分别为3.02%、3.23%、2.96%、2.62%，选择55%、70%、80%乙醇作为正交试验考察因素。

2.3.2 料液比对白花龙胆花总黄酮含量的影响 精密称取白花龙胆花粉末5份，每份约1 g，25 ℃超声提取2次，提取仪功率220 W，溶剂为70%乙醇，超声时间30 min，料液比分别为1:10，1:20，1:30，1:40，1:50，测定波长为510 nm 处吸光度（A），分别为0.877、0.984、0.912、0.822、0.845，总黄酮含量分别为5.40%、6.06%、5.63%、4.99%、5.21%，选择料液比1:10、1:20、1:30作为正交试验考察因素。

2.3.3 提取时间对白花龙胆花总黄酮含量的影响 精密称取白花龙胆花粉末5份，每份约1 g，25℃超声提取2次，提取仪功率220 W，溶剂为70%乙醇，料液比为1:20，超声提取时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，测定510 nm 处吸光度（A），分别为0.488、0.433、0.590、0.523、0.533,总黄酮含量分别为2.49%、2.21%、3.02%、2.67%、2.72%，选择超声提取时间20 min、30 min、40 min作为正交试验考察因素。

2.4 正交试验 黄酮类化合物是白花龙胆花中的主要有效成分之一，多数均有抗炎抗菌等生物活性，黄酮类化合物分子显弱极性，易溶于乙醇中。根据单因素试验结果，选择乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）为3个考察因素，每个因素设置3个水平，利用L9（3）4正交表做正交试验。见表1。

表1 正交试验因素及水平

精密称取白花龙胆花粉末9份，每份约1 g，加溶剂，摇匀，超声提取2次，过滤，合并滤液，旋除溶剂，将得到的棕黄色浸膏用乙醇定容至25 mL容量瓶中，每一因素水平试验平行操作3次，确保其重现性。正交试验设计及结果，见表2。

3 体内抗炎活性实验

3.1 白花龙胆花醇提物的制备 白花龙胆花干燥药材200 g，粉粹，用试验2.4中得到的最佳工艺条件提取2次，合并滤液，浓缩，冷冻干燥得到干燥粉54.2 g，提取率为27.1%。

3.2 急性毒性实验 将50只小鼠（雌雄兼有）随机分5组，每组10只，对其进行急性毒性实验，并利用SPSS 20.0软件对数据进行计算，得LD50的估计值为18.727 g/kg；95%的置信区间为（15.875，22.528）。

表2 正交试验设计及含量测定结果

3.3 小鼠肉芽肿实验 将滤纸裁剪为0.02 g，置于烧杯中，高压灭菌备用；将60只小鼠随机分6组（雌雄兼有），每组10只，分别是模型组、阿司匹林组、二丁颗粒组、试验药物低剂量组、试验药物中剂量组、试验药物高剂量组，称重，乙醚麻醉，左腹沟处消毒，切开皮肤，埋入灭菌滤纸，缝合；根据体重灌胃（0.8 mL/20 g），模型组用生理盐水，阿司匹林0.208 mg/10 g，二丁颗粒78 mg/10 g，试验药物低剂量11.7 mg/10 g，试验药物中剂量23.4 mg/10 g，试验药物高剂量46.8 mg/10 g。观察小鼠外观、行为、死亡情况；连续给药9 d后无死亡，第10 d根据小鼠体重用10%水合氯醛麻醉后取出滤纸，80 ℃恒温干燥24 h，称纸片重量，计算肉芽肿胀度和肉芽肿胀抑制率。利用软件SPSS 20.00处理实验数据，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。见表3。

表3 各实验组小鼠肉芽肿胀度比较（±s，n=10）

表3 各实验组小鼠肉芽肿胀度比较（±s，n=10）

3.4 小鼠耳肿胀实验 将60只小鼠（雌雄兼有）随机分6组，每组10只，分别是模型组、阿司匹林组、二丁颗粒组、试验药物低剂量组、试验药物中剂量组、试验药物高剂量组，称重，根据体质量灌胃，模型组用生理盐水，阿司匹林0.208 mg/10 g，二丁颗粒78 mg/10 g，试验药物低剂量11.7 mg/10 g，试验药物中剂量23.4 mg/10 g，试验药物高剂量46.8 mg/10 g。观察小鼠外观、行为、死亡情况；连续给药5 d后，于末次给药后30 min后右耳两面涂抹二甲苯20 μL致炎，左耳不涂做对照，1 h后处死，剪下两耳，用打孔器在两耳相同部位取片，称重，计算肿胀度，肿胀抑制率。数据利用SPSS 20.00软件进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。见表4。

表4 各实验组小鼠耳肿胀度比较（±s，n=10）

表4 各实验组小鼠耳肿胀度比较（±s，n=10）

3.5 以白花龙胆花总黄酮提取量为指标，对结果进行方差分析 结果表明，各因素对白花龙胆花中总黄酮的提取影响的顺序是B＞A＞C，（即料液比＞乙醇浓度＞提取时间）。因素A和B与各因素之间具有显著性差异（P＜0.05），即乙醇浓度和料液比对白花龙胆花总黄酮提取量具有显著性影响。因素C与各因素间差异无统计学意义（P＞0.05），即提取时间对白花龙胆花总黄酮提取量无显著影响。见表5。

表5 方差分析结果

4 讨论

黄酮类化合物是一类存在于自然界的，具有2-苯基色原酮结构的化合物，广泛存在于植物药物中，也是植物类药物的主要有效成分之一。目前从植物药物中提取黄酮类化合物方法有加热回流法、超声法、微波法等9种方法[9-10]。本研究中根据前期的预实验和参考文献选择乙醇加热回流法提取白花龙胆花中的黄酮类化合物，并通过单因素试验，选择乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）为3个考察因素，每个因素设置3个水平，进行正交提取试验[11-12]，初步确定蒙药白花龙胆花中提取黄酮类化合物的最佳工艺为 70%乙醇，料液比1:30，超声提取时间20 min，即A2B3C1。

与模型组比较，阿司匹林组、二丁颗粒组、试验药物中剂量组和高剂量组小鼠肉芽肿胀度显著性降低，均有统计学意义（P＜0.05），试验药物低剂量组小鼠肉芽肿胀度无显著性降低，无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，阿司匹林组、二丁颗粒组、试验药物低剂量组、试验药物中剂量组和试验药物高剂量组小鼠耳肿胀度显著性降低，均具有统计学意义（P＜0.05）。耳肿胀实验是将致炎物质二甲苯涂抹于小鼠耳廓，增加其耳廓毛细血管通透性，导致增加渗入组织的液体，形成炎症[13]，是一种常用炎症模型。本研究中根据白花龙胆花在蒙医复方中的实际应用量和急性毒性实验结果，将白花龙胆花醇提物冻干粉分别按11.7 mg/10 g，23.4 mg/10 g和46.8 mg/10 g的3种不同剂量给予耳肿胀炎症模型小鼠。结果显示，23.4 mg/10 g，和46.8 mg/10 g 剂量组具有明显降低模型小鼠耳肿胀度。肉芽肿（增殖相）实验是棉球、海绵、玻璃棒、滤纸等埋入动物局部皮下，可产生与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽增生[14-16]。本研究中分别按11.7 mg/10 g，23.4 mg/10 g和46.8 mg/10 g的3种不同剂量将白花龙胆花醇提物冻干粉给予肉芽肿模型小鼠（埋入滤纸）。结果显示，23.4 mg/10 g，和46.8 mg/10 g 剂量组均具有明显抑制肉芽肿胀度作用。从以上实验结果初步得知，一定浓度的白花龙胆花醇提物具有明显抗炎活性[17-20]。