内异方对子宫内膜异位症模型大鼠核因子-κB信号通路相关因子的影响

宋晓婕 周艳艳 赵莉娜

(河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002)

子宫内膜异位症(EM)是常见的妇科良性疾病，是由本该长在子宫腔的内膜细胞通过输卵管进入盆腔异位生长引发的，以疼痛、进行性加重盆腔粘连和不孕为主要临床表现的一类疾病，给女性的生理和心理带来极大负担〔1〕。目前关于子EM的发病机制是临床研究热点之一，核因子(NF)-κB参与细胞免疫、应激和凋亡的调节，在EM的发生、进展中扮演着重要角色〔2〕。内异方是针对EM行气化瘀，软坚消症的经验药方〔3〕，本文为探讨内异方治疗EM对NF-κB信号通路的影响，对EM模型大鼠采用内异方干预15 d后进行相关mRNA、蛋白表达和血清因子检测。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取无特定病原体级雌性成熟未孕SD大鼠(由广东医学实验动物中心提供)80只，大鼠体重为200～300 g，鼠龄为7～10 w。实验动物的处理按照医学动物伦理相关规定〔4〕给予人道主义关怀，给予自由饮水和饮食，室内温度设置为22℃，湿度50%，每天12 h光照。

1.2药物配制 孕三烯酮(华润紫竹药业有限公司，国药准字H19980020，规格：2.5 mg×8粒/盒)，去除外部胶囊后，将粉末溶于蒸馏水混匀，配制成浓度为0.032 mg/ml的孕三烯酮混悬液，置于4℃冰箱备用。内异方(由炒当归、丹参、赤芍、制香附、血竭、川牛膝等12味中药构成，共100.5 g)是由河南省中医院中药房提供，用蒸馏水洗净，煎煮，过滤和浓缩为3.58 g/ml药液，冷却后置于4℃冰箱备用。

1.3建模 将80只大鼠随机分为空白对照组、模型组、内异方组和孕三烯酮组，每组20只，除空白对照组外，将其余3组大鼠自体子宫内膜移植于肠系膜上建立 EM大鼠模型，具体方法为：术前2 d肌内注射4 mg/2 ml的苯甲酸雌二醇(天津金耀药业有限公司，国药准字H12020529，规格：1 ml∶1 mg)，使大鼠处于相同动情周期，禁食12 d后，超净台内操作大鼠，采用水合氯醛(10%自配灭菌)行腹腔麻醉，开腹后找到子宫，游离左侧子宫行结扎后切除1 cm长度的子宫段放入无菌生理盐水中，切割成4片后缝合在右侧肠系膜血管丰富处，腹腔留置青霉素钠(广州白云山天心制药，国药准字H44022448，规格160 IU×20瓶)0.25 ml，缝合腹腔壁，分笼饲养。术后3 d连续每天1次注射青霉素钠0.25 ml，术后第2天肌内注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg。

1.4分组给药 空白对照组与模型组给予0.2 ml生理盐水，每天1次灌胃，内异方组根据大鼠体重给予配置好的内异方药液35.88 g/kg，每天1次灌胃，孕三烯酮组根据大鼠体重给予孕三烯酮备用混悬液0.325 mg/kg，每周2次灌胃，4组均连续干预15 d。

1.5观察和检测指标 药物干预结束后，对大鼠采血，分离血清，采用酶联免疫吸附试验检测血清学指标：白细胞介素(IL)-6、IL-1b、肿瘤坏死因子(TNF)-α、神经生长因子(NGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。处死大鼠后开腹，观察比较建模3组内异灶数目和体积，并对盆腔粘连程度进行评分〔1〕：粘连面积<25%计为1分，25%≤粘连面积<50%计为2分，粘连面积≥50%计为3分；粘连程度疏松、无血管粘连计为1分，致密粘连、血管粘连计为2分，无组织界面粘连计为3分；无卵巢粘连计为0分，卵巢单侧粘连计为1分，卵巢双侧粘连计为2分。以粘连面积、粘连程度和卵巢粘连3个方面分数相加计为粘连评分。

取建模3组EM病灶附着点周围腹膜组织，空白对照组留取盆腔正常腹膜组织，生理盐水清洗后，将每块组织分为2份。1份组织采用免疫组化的方法检测组织中NF-κB、NF-κB抑制因子(IκB)和IκBs激酶(IκK)的蛋白相对表达量，另一份采用反转录酶-聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)测定NF-κB、IκB和IκK的mRNA定量。

1.6统计学处理 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.13组建模大鼠给药后盆腔内异灶数目、体积和粘连程度评分比较 给药干预15 d后内异方组和孕三烯酮组盆腔粘连评分、内异灶数目和体积明显小于模型组(P<0.05)，内异方组与孕三烯酮组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.24组给药后IκK、IκB、NF-κB mRNA表达量比较 与空白对照组相比，其余3组腹腔组织IκK和NF-κB mRNA的含量明显升高，IκB mRNA含量显著降低(均P<0.05)；与模型组相比，孕三烯酮组与内异方组IκK和NF-κB mRNA含量均明显降低，而IκB mRNA含量明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；内异方组对三种 mRNA含量的改善程度明显优于孕三烯酮组(P<0.05)。见表2。

表1 3组建模大鼠给药后盆腔内异灶数目、体积粘连评分比较

与模型组比较:1)P<0.05

表2 4组给药后IκK、IκB、NF-κB mRNA表达量比较

与空白对照组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05；与孕三烯酮组比较:3)P<0.05；下表同

2.34组给药后IκK、IκB、NF-κB 蛋白表达水平比较 与空白对照组相比，其余3组腹腔组织IκK和NF-κB蛋白表达水平明显升高，IκB 蛋白表达水平显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与模型组相比，孕三烯酮组与内异方组IκK和NF-κB蛋白表达量均明显减少，而IκB蛋白的表达水平增加，差异均有统计学意义(均P<0.05)；内异方组对三种蛋白表达水平的改善程度明显优于孕三烯酮组(P<0.05)。见表3。

2.44组给药后血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF比较 与空白对照组相比，模型组血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF水平明显升高(P<0.05)；孕三烯酮组与内异方组血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF水平明显低于模型组(P<0.05)，内异方组上述血清指标改善程度均显著优于孕三烯酮组(P>0.05)。见表4。

表4 4组给药后血清IL-6、TNF-α、IL-1β 、NGF和VEGF水平比较

3 讨 论

西医在治疗EM主要采用手术和激素类药物，存在一定局限性，难以根治。中医目前主要用于EM的保守治疗或结合西医的辅助治疗，本研究采用的内异方是根据蔡庄治疗EM加以总结而来的经验方，采用血竭破除积血，生心血，海藻、炙甲片活血、软坚散结，皂角刺、川牛膝、赤芍、丹参、桂枝活血祛瘀，炒当归、制香附调经止痛，干漆消散症瘕，诸药配伍合奏行气破瘀、软坚消症功效〔5～7〕。

NF-κB是一种蛋白复合物，几乎存在于所有动物细胞中，参与细胞应激、免疫和凋亡等过程的调节，已有研究表明NF-κB在EM患者中表达异常，是EM重要的病因学因素之一〔8,9〕。本研究结果显示IκB能抑制NF-κB的表达，而IκK则通过使IκB的N端亚基磷酸化从而被降解，降低NF-κB活性及表达，并促使相关促炎因子表达与分泌下调〔10〕。本研究结果说明内异方和孕三烯酮都能抑制内异灶生长，降低盆腔粘连程度。内异方如前面提到的具有活血软坚功效，孕三烯酮属于雄激素衍生物，有抗孕激素、雌激素和性腺激素的效果，由于EM具有雌激素依赖性，孕三烯酮能通过降低雌激素水平使其萎缩，达到治疗效果〔11,12〕。内异方组改善幅度高于孕三烯酮组，提示内异方可能通过抑制IκK和上调IκB基因的表达，来抑制NF-κB蛋白的合成发挥其疗效，而孕三烯酮对NF-κB的调节作用没有内异方显著。

异位子宫内膜细胞NF-κB被激活，可以促进巨噬细胞释放促炎因子IL-6、IL-1b，同时NF-κB又是VEGF基因启动中的关键调控因子，它正向调节VEGF从而促进血管生成，血管生成常伴随了神经的生长，NGF是介导异位子宫内膜神经生长的重要因子，NGF水平相应升高，进一步导致EM病变发生和进展〔13,14〕。本研究提示，孕三烯酮组直接改善大鼠血清学指标，而内异方能通过NF-κB信号通路下调血清炎性因子和血管神经相关因子水平从而降低大鼠体内炎症水平〔15〕。