渥曼青霉素对高糖培养小鼠胰岛β细胞去分化的影响

高倩 章文俊 杨国军 潘晔 陈乃君 朱巍 金华伟

叉头转录因子（forkhead box O，FoxO）是 Forkhead蛋白大家族的一个亚群，哺乳动物中分别由4个截然不同的基因编码组成 FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6，其中FoxO1主要表达在胰腺β细胞、肝细胞、脂肪细胞。FoxO1是一种多功能蛋白，参与调节细胞增殖、凋亡、衰老、分化、应激、自噬和代谢。目前研究发现FoxO1可抑制胰岛α细胞向β细胞转化、保护β细胞免受氧化应激损伤、维持β细胞终末分化状态[1-2]。FoxO1的活性主要受磷酸化/去磷酸化水平调节，磷脂酰肌醇-3激酶（phospoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）信号通路是调节FoxO1磷酸化的主要上游信号通路[3]。渥曼青霉素是PI3K家族的强效抑制剂[4]。近年来研究发现小鼠胰岛β细胞在高糖培养诱导下发生去分化，并发现磷酸化的FoxO1表达改变[5]，但迄今有关FoxO1活性抑制对高糖所致的小鼠胰岛β细胞去分化影响的研究较少见。为进一步证实FoxO1活性抑制剂对胰岛β细胞去分化的作用，笔者拟观察FoxO1磷酸化抑制剂渥曼青霉素对高糖培养的小鼠胰岛β细胞去分化的影响，以探讨其作用机制，并为其进一步的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂与细胞 小鼠胰岛β细胞购自中南大学细胞室，HTCC编号：9号。渥曼青霉素（批号：200706，中国Solarbio公司），DMEM培养液（美国HyClone公司），胎牛血清（FBS）（澳大利亚Bovogen公司），磷酸化FoxO1（p-FoxO1）（位点：256）一抗、FoxO1、β 前体细胞标志物神经元素3（neuroelement3，ngn3）和β细胞标志物胰岛十二指肠同源盒-1（pancreatic duodenal homeobox-1，PDX1）一抗（中国Bioworld公司），HRP标记二抗（美国Jackson公司），逆转录试剂盒（RR037A）和 SYBR Premix Ex TapTM（RR420）（日本 TaKaRa 公司），Molecular Imager ChemiDocTMXRS+成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 小鼠胰岛β细胞用10%FBS、葡萄糖浓度25mmol/L的DMEM培养液，置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养，每2～3d更换细胞培养液，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 确定高糖培养刺激小鼠胰岛β细胞FoxO1蛋白磷酸化最佳时间 采用蛋白质印迹法（Western blot）。小鼠胰岛β细胞培养贴壁生长至100%融合后，更换为无血清培养液同步培养24h，用60mmol/L高糖培养液进行干预，预定时间（0、12、24、48h）收集细胞，用预冷的含50mmol/L氟化钠、1mmol/L钒酸钠的细胞裂解液（使用前加入苯甲基磺酰氟）冰上裂解30min，收集裂解液，4℃，13 000rpm离心5min后收集上清液，BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度，操作按说明书。5×上样缓冲液变性蛋白后-20℃保存。取40μg总蛋白上样，用10%浓度的SDS-PAGE凝胶进行电泳。恒流将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温摇床封闭2h，分别加入p-FoxO1、FoxO1、β-actin一抗，4℃过夜，洗膜后分别加入相应的HRP标记的二抗，孵育后洗膜，ECL化学发光显色，Molecular Imager ChemiDocTMXRS+成像系统自动曝光扫描并用Image Lab软件分析结果，以所测得的各条带的吸光度与内参照β-actin吸光度的比值作为半定量值。通过比较不同时间点p-FoxO1和FoxO1蛋白表达水平，确定高糖培养刺激小鼠胰岛β细胞FoxO1蛋白磷酸化最佳时间。

1.2.3 实验分组 小鼠胰岛β细胞培养贴壁生长至100%融合后，更换为无血清培养液同步培养24h，再根据培养条件分为4组：（1）常规糖浓度（RG）组：用含25mmol/L葡萄糖浓度的DMEM培养液培养；（2）高张浓度（RG+M）组：用含25mmol/L葡萄糖浓度和35mmol/L甘露醇的DMEM培养液培养，作为高张对照组；（3）高糖浓度（HG）组：用含60mmol/L葡萄糖浓度的DMEM培养液培养，作为干预组；（4）高糖浓度+渥曼青霉素干预（HG+W）组：用含60mmol/L葡萄糖浓度和50nmol/L渥曼青霉素的DMEM培养液培养，作为干预组。

1.2.4 各组小鼠胰岛β细胞p-FoxO1、FoxO1蛋白表达水平检测 经不同培养液培养12h后（根据1.2.2确定得到），收集各组小鼠胰岛β细胞，采用Western blot法（方法同1.2.2）检测p-FoxO1、FoxO1蛋白表达情况。

1.2.5 各组小鼠胰岛β细胞ngn3、PDX1蛋白和mRNA表达水平检测 经不同培养液培养72h后，收集各组小鼠胰岛β细胞，采用Western blot法（方法同1.2.2）检测ngn3、PDX1蛋白表达情况。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测ngn3、PDX1 mRNA表达情况，具体方法如下：采用Trizol法提取细胞总RNA，分光光度计检测RNA浓度及纯度，并逆转录为cDNA。用SYBR Green荧光染料定量PCR扩增。引物设计采用Primer Premier 5.0软件包。引物的特异性比对采用NCBI的Primer BLAST。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。实时荧光定量聚合酶链式反应法采用20μl体系，SYBR 荧光染料 10μl、上下游引物各 0.5μl、DEPC 水8μl、cDNA 1μl。以 β-actin 为内参。各引物序列如下：ngn3 上游引物：5′-GCTCCGAAGCAGAAGTGG-3′，下游引物：5′-TTGTAAGTTTGGCGTCATCC-3′；PDX1 上游引物：5′-CTCCACCACCACCTTCCA-3′，下游引物：5′-GCTGTGTAAGCACCTCCTG-3′；β-actin 上游引物：5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游引物 5′-ATGTCACGCAGATTTCC-3′。用SYBR Green荧光染料定量聚合酶链式反应法分析，扩增条件为95℃预变性30s；随后 95℃ 5s，60℃ 20s，40 个循环。采用相对定量 2-ΔΔCT计算基因表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；组内不同时间点比较采用重复测量数据的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 确定高糖培养刺激小鼠胰岛β细胞FoxO1蛋白磷酸化最佳时间 与0h比较，60mmol/L高糖培养12、24、48h后小鼠胰岛β细胞p-FoxO1蛋白表达水平均明显增加，差异有统计学意义（均 P＜0.01）；但 12、24、48h小鼠胰岛β细胞p-FoxO1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；提示高糖培养12h可以刺激小鼠胰岛β细胞FoxO1信号分子发生磷酸化。与0h比较，60mmol/L高糖培养12、24、48h后小鼠胰岛β细胞Fox－O1蛋白表达水平均无明显改变，差异均无统计学意义（均 P＞0.05），见图 1。

图1 确定高糖培养刺激小鼠胰岛β细胞FoxO1蛋白磷酸化最佳时间（a：各时间点细胞p-FoxO1和FoxO1蛋白表达的电泳图；b：各时间点细胞p-FoxO1和FoxO1蛋白表达水平；与0h比较，*P＜0.01）

2.2 渥曼青霉素对高糖培养小鼠胰岛β细胞p-Fox－O1、FoxO1蛋白的影响 与RG组比较，HG组小鼠胰岛β细胞p-FoxO1蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；但RG组和RG+M组小鼠胰岛β细胞p-FoxO1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与HG组比较，HG+W组小鼠胰岛β细胞p-FoxO1蛋白表达水平减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组小鼠胰岛β细胞FoxO1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见图 2。

图2 渥曼青霉素对高糖培养小鼠胰岛β细胞FoxO1磷酸化的影响（a：各组细胞p-FoxO1和FoxO1蛋白表达的电泳图；b：各组细胞p-FoxO1和FoxO1蛋白表达水平；与RG组比较，*P＜0.01；与 HG 组比较，△P＜0.05）

2.3 渥曼青霉素对高糖培养小鼠胰岛β细胞ngn3、PDX1蛋白和mRNA表达水平的影响 与RG组比较，HG组小鼠胰岛β细胞ngn3蛋白和mRNA表达水平均明显增加，PDX1蛋白和mRNA表达水平均明显减少，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；但RG组和RG+M组小鼠胰岛β细胞ngn3、PDX1蛋白和mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与HG组比较，HG+W组小鼠胰岛β细胞ngn3蛋白和mRNA表达水平均明显减少，PDX1蛋白和mRNA表达水平均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

3 讨论

糖尿病的病因和发病机制极为复杂，至今未完全阐明。胰岛素作为人体内唯一的降糖激素，由胰岛β细胞合成和分泌。目前研究认为，遗传和环境因素共同作用导致胰岛β细胞功能缺陷，最终导致糖尿病的发生和发展[6]。对于β细胞减少的主要形式目前存在争议：（1）β细胞发生凋亡；（2）β细胞发生去分化。过去一直认为β细胞凋亡是β细胞减少的主要形式，但是目前研究认为胰岛β细胞去分化是导致β细胞衰竭的重要致病机制[7-8]。研究表明，在一定病理条件下胰岛β细胞可去分化为内分泌前体细胞[9]。PDX1为内分泌细胞转录因子，是β细胞重要的基因表达，是反映胰岛β细胞特征的重要标志物，ngn3与POU结构域5类转录因子 1（Oct4）为内分泌祖细胞标志物[10]。因此，本实验选择ngn3、PDX1作为观察小鼠胰岛β细胞是否发生去分化的指标。

图3 渥曼青霉素对高糖培养小鼠胰岛β细胞ngn3、PDX1蛋白和mRNA表达水平的影响（a：各组细胞ngn3蛋白表达的电泳图；b：各组细胞ngn3和PDX1蛋白表达水平；c：各组细胞ngn3和PDX1 mRNA表达水平；与RG组比较，*P＜0.01；与HG组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01）

糖尿病状态或高糖可诱导胰岛β细胞去分化。本研究结果表明，小鼠胰岛β细胞在60mmol/L高糖条件下培养72h后，β细胞标志物PDX1表达下降，而β前体细胞标志物ngn3表达升高，表明高糖环境能诱导小鼠胰岛β细胞发生去分化，与刘婵等[5]的研究结果一致，但是本实验采取的高糖浓度为60mmol/L，远高于刘婵等采取的40mmol/L高糖浓度。

渥曼青霉素是一种PI3K家族的强效抑制剂，可抑制FoxO1的磷酸化，FoxO1 S256位点磷酸化后，FoxO1与伴侣蛋白14-3-3结合促进FoxO1向核外转运，14-3-3蛋白封闭了核定位信号，阻止FoxO1向核内转运，使FoxO1不能与DNA结合区结合而失活[11]。已有研究发现FoxO1基因敲除的小鼠在妊娠、多产等情况发生β细胞去分化，最终发展成糖尿病[10]。为了进一步探索FoxO1在高糖诱导β细胞去分化中的作用机制，笔者根据前期实验结果，选择在安全浓度范围内的浓度50nmol/L作为渥曼青霉素的实验浓度，探讨其对高糖培养胰岛β细胞去分化影响。本实验发现小鼠胰岛β细胞在60mmol/L高糖条件下培养12h后出现FoxO1分子的磷酸化，并且该作用一直持续到48h，结合高糖能诱导小鼠胰岛β细胞发生去分化，笔者继续探索利用渥曼青霉素抑制FoxO1磷酸化能否抑制高糖诱导的小鼠胰岛β细胞去分化。本实验发现，渥曼青霉素同步干预后，渥曼青霉素能抑制高糖诱导的小鼠胰岛β细胞去分化现象。

综上所述，本实验发现渥曼青霉素能抑制高糖诱导的小鼠胰岛β细胞去分化，渥曼青霉素可能通过抑制FoxO1的磷酸化而产生该抑制作用的。