白及二氢菲类化合物对临床常见病原菌作用的研究

2020-04-16李华彭音陈芳张琴储士润

安徽医药 2020年4期

李华，彭音，陈芳，张琴，储士润,2

白及［Bletilla striata（Thunb.）Rchb.f.，B.striata］属兰科植物，其假鳞茎是一种常用的中药材，具有抗菌、止血、生肌等功效［1-2］。二氢菲类化合物（Dihydrophenanthropyrans）是目前研究的从白及块茎中分离得到的含量较多的药用成分［3］。俞杭苏等［4］和刘珈羽等［5］的研究表明，白及主要提取物对革兰阳性菌的抑菌活性明显比对革兰阴性菌的强。近年来也有研究发现，从白及块茎中分离的二氢菲类化合物对白假丝酵母菌等真菌也有抑制作用，而且白及化合物的抗菌活性与其结构有关，对甲氧基化合物的抗菌作用减弱而对羟基苄化合物的抗菌活性增强［6］。但他们均未对白及二氢菲类化合物对临床常见病原菌的抗菌性开展系统研究。

2017年全国细菌耐药监测报告给出了2017年主要临床分离菌种分布的前20位，其中大肠埃希菌、克雷伯菌属、不动杆菌属、金葡菌、铜绿假单胞菌位于前五的位置，而且白假丝酵母菌也是临床最常见的致病真菌。因此，对于这6种临床常见病原菌的研究，以及开发针对这些病原菌的临床新型抗生素的研究，具有重要意义。近年来，由于广谱抗生素的不合理使用，包括医学、农业、畜牧业及工业中抗生素的滥用使得临床常见致病菌获得性耐药［7-9］，加上基因迁移促进细菌群体的耐药性传播而导致的细菌耐药迅速蔓延［10］以及人们对耐药菌检测不力，导致多重耐药菌快速增加［11］。目前，对多重耐药菌和逆转细菌多重耐药性的研究已成为亟待解决的重要课题。

在前期研究中，本课题组已成功建立白及的植物组培快繁技术体系、愈伤组织诱导、原生质体诱导和培养基础体系和细胞悬浮技术体系。本研究拟从优良江油产白及品系的愈伤组织、悬浮培养细胞和三年生块茎共3种材料中进行二氢菲类化合物成分的分离提取，进一步开展3种材料中二氢菲类成分对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和白假丝酵母菌6种临床菌株的抑菌作用研究，试阐释白及二氢菲类化合物对临床常见致病菌的药理作用特征，为其临床应用奠定实验基础，也为江油白及的药用产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

本研究的临床菌株，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）、大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，K.pneumonia）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，A.baumannii）、白假丝酵母菌（Candida albicans，C.albicans），均是在江油市第二人民医院重症监护室临床病人的痰标本中分离出来的临床菌株，实验时间从2017年5月至2018年5月。实验用标准菌株：金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、大肠埃希氏菌（ATCC35218）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、鲍曼不动杆菌（ATCC19606）、白假丝酵母菌（ATCC90028）由四川省临床检验中心提供。实验用抗生素药敏纸片头孢呋辛（Cefuroxim，CXM，30 ug/L）、头孢曲松（Ceftriaxone，CTR，30 ug/L）、美罗培南（Meropenem，MEM，10 ug/L）、伏立康唑（Voriconazole，VOR，1 ug/L）、伊曲康唑（Itraconazole，IRC，10 ug/L），这5种抗生素为本院临床常用抗生素。实验用平板培养基为L-B培养基。白及蒴果和三年生块茎采集于江油市义新乡茅庵村中药材种植地。

1.1 白及实验材料的制备取成熟未开裂的白及蒴果，利用白及组培快繁技术体系，诱导出白及原球茎，取一部分原球茎放入细胞悬浮培养技术体系，培养出悬浮培养细胞组织；另一部分原球茎继续诱导成愈伤组织，取悬浮培养细胞和愈伤组织备用。将以上细胞组织和采集的三年生白及块茎鲜品称重，放入60℃鼓风干燥箱中烘干至恒重。然后，分别取适量干品研磨，过60目筛，得白及悬浮培养细胞干粉、愈伤组织干粉和块茎干粉备用。最后，将上述各白及干粉中的二氢菲类化合物参照靳冉等的方法进行分离和测定，实验用二氢菲类标准品为2.7-二羟基-4-甲氧基-9.10-二氢菲。

1.2 二氢菲类化合物的抗菌性鉴定和抗菌浓度筛选按CLSI2017推荐的琼脂稀释法测定实验临床6种菌株和标准菌株的MIC值，取不同白及材料中分离获取的二氢菲类化合物按倍比稀释法制备琼脂平板，使终浓度分别在0.1～10.0 mg/mL之间［5］形成11个不同的浓度梯度，菌株生长受到抑制时的浓度为最低抑菌浓度（MIC值）。试验设三次重复，取平均值。

1.3 药敏验证实验将复苏的菌株配置成浓度为0.5麦氏单位的菌悬液，用无菌棉签将其均匀涂布于M-H琼脂培养基上。然后在L-B平板上分别贴上头孢呋辛，头孢曲松，美罗培南，伏立康唑，伊曲康唑的药敏纸片，各纸片中心相距＞24 mm，纸片距平板内缘＞15 mm，贴上后轻轻按压纸片表面且不可移动药敏纸片。接着将平板置于35℃恒温箱中培养，取出观察，在24 h时用游标卡尺测量抑菌圈的直径。试验设三次重复，每次测量三次，取平均值。

将上述较易获得的白及块茎二氢菲类化合物干粉用超纯水溶解，倒入M-H琼脂培养基中使二氢菲类化合物的浓度为MIC值，并混匀制成含药平板。接着采用连续划线接种法，将已配置好的0.5麦氏单位的菌悬液涂布于加入上述培养基中。然后在培养细菌的每个平板上分别贴上头孢呋辛，头孢曲松，美罗培南3种抗生素药敏纸片；在培养真菌的每个平板上分别贴上伏立康唑，伊曲康唑2种抗生素药敏纸片。最后将其置于35℃恒温箱中培养，取出观察，在24 h时用游标卡尺测量抑菌圈的直径。试验设三次重复，每次测量三次，取平均值。实验对比以上两次实验抑菌圈直径的变化，判断白及二氢菲类化合物是否具有逆转临床菌株耐药性等作用。

1.4 统计学方法所有实验数据均采用SPSS21.0统计软件分析，实验结果以±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析，计算P值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种材料白及二氢菲类化合物含量的测定实验称取3种白及材料的干粉各100 g，采用高效液相色谱纯化检测后的二氢菲类化合物含量和9，10-二氢菲含量如表1所示。通过表1可以看出，每100 g白及干粉中，二氢菲类化合物含量和9，10-二氢菲含量从高到低的顺序依次为：白及悬浮细胞组织＞白及块茎＞白及愈伤组织，其中二氢菲类化合物和9，10-二氢菲含量最大的均是白及悬浮细胞组织，分别为401μg和58μg，同时3种白及材料中二氢菲类化合物含量均差异有统计学意义，而9，10-二氢菲含量只有愈伤组织与其他材料差异有统计学意义。

表1 100 g白及组织中二氢菲类化合物和9，10-二氢菲含量的检测结果/（μg，±s）

注：愈伤组织Dihs含量与悬浮细胞比较，t＝0.002，P＝0.000。9，10-Dih含量与悬浮细胞比较，t＝0.012，P＝0.001。块茎Dihs含量与悬浮细胞比较，t＝0.004，P＝0.002。9，10-Dih含量与悬浮细胞比较，t＝0.636，P＝0.078

9，10-Dih含量58±7 29±4 51±6白及材料悬浮细胞愈伤组织块茎Dihs含量401±14 329±11 353±13

2.2 白及二氢菲类化合物对6种菌株的最低抑菌浓度用含不同白及材料提取的二氢菲类化合物的LB液体培养基培养实验用6种菌，菌株菌落的数目、大小随着二氢菲类化合物浓度的增加而减小，当二氢菲类化合物浓度达到临界值时，由于二氢菲类化合物对菌株的抑制作用太大而导致菌株不能生长甚至死亡。当二氢菲类化合物浓度达到抑菌浓度临界值时，菌株大部分生长受到抑制而只有少数能够维持基础生长，因此培养皿中只有稀疏的少量菌落出现。白及二氢菲类化合物的最低抑菌浓度平均值如表2所示，菌落生长情况如图1所示。

表2 三种白及组织的二氢菲类化合物对6种菌株的最低抑菌浓度（MIC）

当悬浮细胞二氢菲类化合物浓度为0.58 mg/mL时，培养金黄色葡萄球菌菌株的培养基中生长出稀疏的单菌落，甚至再培养基上无菌落生长，因此悬浮细胞二氢菲类化合物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度平均值为0.58 mg/mL。同理，悬浮细胞二氢菲类化合物对铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、白假丝酵母菌，最低抑菌浓度平均值依此为1.65 mg/mL、1.23 mg/mL、1.39 mg/mL、1.73 mg/mL、3.10 mg/mL。通过表2还可以看出，不同种材料的二氢菲类化合物对菌株的MIC平均值最小值和最大值也不尽相同，例如金黄色葡萄球菌MIC最小值为悬浮细胞是0.58 mg/mL、最大值为块茎二氢菲类化合物是0.62 mg/mL，而白假丝酵母菌MIC平均值最小值为愈伤组织是3.07 mg/mL、最大值为悬浮细胞二氢菲类化合物是3.10 mg/mL，同时，同种白及材料的二氢菲类化合物对不同种菌株的最低抑菌浓度差异有统计学意义，而3种白及材料的二氢菲类化合物对每种菌株的最低抑菌浓度差异无统计学意义。

通过表2还可以看出，白及二氢菲类化合物对金黄色葡萄球菌的MIC值最小，即对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强，而对白假丝酵母菌的MIC值最大，即对白假丝酵母菌抑菌作用最弱。同时，二氢菲类化合物对铜绿假单胞菌等临床常见的革兰阴性杆菌均具有一定的抑制作用，其中对大肠埃希氏菌的抑菌作用最强（图1）。

从实验结果还可以看出，二氢菲类化合物对临床菌株的抑制作用较强，而对标准菌株抑制作用较弱。

表3 二氢菲类化合物作用前6种菌株对抗生素敏感性结果分析/（mm，±s）

注：表中“—”表示未检测此项数据

菌株药敏圈直径VOR IRC金黄色葡萄球菌ATCC29213铜绿假单胞菌ATCC27853大肠埃希氏菌ATCC35218肺炎克雷伯菌ATCC700603鲍曼不动杆菌ATCC19606白假丝酵母菌ATCC90028 CXM 33.6±2.0 34.1±2.5— —21.3±0.1 25.7±0.7 16.8±6.2 23.2±1.3 15.6±0.2 19.5±2.1 CTR 32.0±1.6 32.0±2.5 19.2±0.8 26.6±0.8 31.7±2.1 37.9±1.1 28.0±2.0 32.0±2.1 16.0±0.4 22.5±1.0 MEM 19.2±0.1 32.8±0.8 12.1±0.4 20.3±0.8 28.9±1.0 25.3±0.2 25.0±0.8 25.8±0.8 18.4±0.6 20.5±2.5————17.8±0.4 18.9±0.2— —— ———14.7±0.5 16.1±0.4

表4 二氢菲类化合物作用后6种菌株对抗生素敏感性结果分析/（mm，±s）

注：表中“—”表示未检测此项数据

菌株药敏圈直径IRC CTR 34.4±1.1 36.4±0.1 20.8±2.3 27.2±0.6 34.3±1.1 39.2±1.4 28.1±1.9 33.1±1.1 16.6±1.1 27.6±1.6 CXM 34.7±0.7 35.7±0.6 MEM 20.6±0.1 36.1±3.2 16.3±4.1 19.3±0.8 28.3±0.2 25.3±0.2 30.5±1.1 27.7±0.8 18.3±0.7 18.0±1.1 VOR金黄色葡萄球菌ATCC29213铜绿假单胞菌ATCC27853大肠埃希氏菌ATCC35218肺炎克雷伯菌ATCC700603鲍曼不动杆菌ATCC19606白假丝酵母菌ATCC90028— —25.6±1.6 27.6±1.4 22.6±2.0 24.9±0.6 17.1±0.7 23.1±1.4————21.3±0.7 19.4±0.1— —— —— —19.1±0.8 18.2±0.1

2.3 菌株药物敏感性实验结果分析白及块茎的二氢菲类化合物对菌株作用前后，6种菌株对抗生素药物的敏感性变化情况如表3和表4所示。从两个表中可以看出，二氢菲类化合物作用金黄色葡萄球菌后使其头孢呋辛、头孢曲松、美罗培南的抑菌圈直径分别从33.6 mm、32.0 mm、19.2 mm增加到34.7 mm、34.4 mm、20.6 mm，肺炎克雷伯菌、白假丝酵母菌和金黄色葡萄球菌表现相似，其中对白假丝酵母菌作用最为显著，抑菌圈直径平均增加了4.4±0.3 mm；而当二氢菲类化合物作用于大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌的美罗培南后，其抑菌圈直径分别从28.9 mm、18.4 mm降低到28.3 mm、18.3 mm。

在本研究中，我们可以推测二氢菲类化合物可以增强金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌对头孢呋辛，头孢曲松，美罗培南3种抗生素的敏感性，也可以增强白假丝酵母菌对伏立康唑，伊曲康唑的敏感性，但影响白假丝酵母菌对抗生素敏感性的增强作用没有对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等细菌的作用强。同时，对作用于大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌的抗生素美罗培南，二氢菲类化合物表现出的是降低了细菌对美罗培南敏感性的作用。还可以发现白及二氢菲类化合物可以使一些抗生素对金黄色葡萄球菌（2A）、铜绿假单胞菌（2B）、大肠埃希氏菌（2C）、肺炎克雷伯菌（2D）的抑菌圈由耐药状态变为敏感或中介状态。见图2。

综上所述，二氢菲类化合物有增强临床常见病原菌对抗生素敏感性的作用，但是对某些抗生素，二氢菲类化合物也有降低常见病原菌对抗生素的敏感性的作用，同时也具有逆转常见病原菌耐药性的作用。

3 讨论

在白及二氢菲类化合物含量测定的实验中，发现二氢菲类化合物含量和9，10-二氢菲含量最高的均是白及悬浮细胞组织，而且实验中从白及悬浮细胞组织材料中提取出的二氢菲类化合物对临床常见病原菌的作用与其他材料无差异。实验用白及悬浮细胞组织是通过前期构建的植物细胞悬浮培养技术体系的培养，经过分离、提纯得到的细胞组织，具有分散性好、细胞形态均一、生长迅速、重复性好、易于控制等特点［12-13］。因此，白及悬浮细胞组织可用于白及药理作用成分的大规模工厂化生产及作为转变白及药用活性成分生产方式的物质基础，也可作为胚性材料用于植物遗传育种和植物生长发育等研究［14］。因此，将白及悬浮细胞组织作为白及植株的替代品，从中获得药用活性成分含量高的实验研究性材料和应用于医药领域的药源性材料，具有重大应用价值和广阔的市场前景，同时对于白及的资源保护、开发利用及可持续发展有着重要的促进意义。

在白及二氢菲类化合物抑菌作用的研究中，发现二氢菲类化合物具有较强的抑制临床常见病原菌生长的作用，并且二氢菲类化合物对革兰阳性菌的抑菌活性比对革兰阴性菌的强，对真菌的抑制作用较弱，这与俞杭苏等［4］、刘珈羽等［5］的研究结果类似。但在本研究中，实验系统具体的研究了江油地区白及3种材料中二氢菲类有关成分对临床常见病原菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、白假丝酵母菌的抑菌特点和MIC值，这为江油地区白及药用活性成分的临床应用研究提供了数据支撑和理论依据。同时，我们还发现江油地区白及二氢菲类化合物对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌的抑制作用比对铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、白假丝酵母菌的抑制作用强，而且还发现白及二氢菲类化合物对临床菌株的抑制作用较强，而对标准菌株抑制作用较弱（表2，图1），这与前人的研究结果有不同的地方，这可能与中草药白及种质、有效成分提取方法、菌种及病原菌的临床菌株耐药性等因素有关［15-16］。

本研究还发现，白及二氢菲类化合物具有增强某些抗生素对临床病原菌的作用，同时也具有逆转常见病原菌对某些抗生素耐药性的作用。近年来，临床病原菌的多重耐药问题，已经成为现在微生物专业研究的热点问题［17-19］。二氢菲类化合物是白及天然活性成分，具有绿色、安全、高效、毒副作用小等优点［20］，同时本研究证实了白及二氢菲类化合物具有逆转金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌等病原菌耐药性的作用，这无疑为解决临床病原菌多重耐药的问题提供了新的解决问题的思路。但是白及二氢菲类化合物是否具有逆转细菌多重耐药性以及其逆转多重耐药性机制和抑制细菌生长机制，还有待进一步实验探索。

本实验通过白及二氢菲类化合物同病原菌共培养来验证二氢菲类化合物的抑菌作用，实验中二氢菲类化合物需经过高温高压灭菌的过程，这可能导致其药理活性的改变，加之实验中采用的提取方法会导致白及有效成分提取不充分，一定程度上会影响实验的结果。但由于本实验重复次数较多，实验数据庞大，经统计学分析，排除95%CI之外的数据，因此，实验结果准确可靠。本研究结果为具有抑菌作用中草药应用于临床病原菌研究以及中草药有效成分作为新型抗生素原材料的研究奠定了理论和实验基础。

（本文图1，2见插图4-4）