过氧化氢酶表达与腰椎管狭窄症病人黄韧带肥大

陈通，陈焕诗，易军飞

腰椎管狭窄症（LSCS）是最常见的脊柱疾病之一。而黄韧带（LF）肥大在LSCS的发生中起重要作用［1］。当黄韧带中弹性蛋白与胶原蛋白的比例降低时，弹性降低，僵硬或纤维化增加。这导致椎管狭窄，压迫硬膜囊和神经根，即使在没有纤维环，突出的髓核或骨刺的情况下也会导致症状［2］。虽然黄韧带的肥大和纤维化被认为是由于衰老过程继发的退行性变化和继发于不稳定性的机械应力而发生的，但黄韧带肥大的精确发病机制仍然未知［3］。以前的研究报道了各种分子在椎管狭窄病人中的表达和活性增加，包括基质金属蛋白酶（MMPs）、miR-155、转化生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子、骨形态发生蛋白和炎性细胞因子［4］。例如，有研究表明黄韧带成纤维细胞中活性MMPs（MMP-2和MMP-13）的表达增加可能与患有LSCS的病人的弹性蛋白降解和黄韧带纤维化有关［5］。椎管狭窄病人的MMP-2和MMP-13值明显高于椎间盘突出症病人。其他研究表明，由黄韧带成纤维细胞合成并增加胶原合成的TGF-β1与肥大有关［6］。之前有研究者探讨了黄韧带肥大与miRNA表达之间的关系，发现miR-155在腰椎黄韧带肥大病人中表达上调［7］。他们还报道了miR-155的表达水平与黄韧带的纤维化厚度和程度相关［8］。DNA损伤和核碱基不稳定也可能导致LSCS。氧化应激是由促氧化剂和抗氧化剂稳态失衡引起的，可能导致产生高水平的活性氧（ROS）。已知高水平的ROS会对人体细胞中的脂质，蛋白质和DNA造成损害［9］。之前的研究证实LSCS病人在肥大性黄韧带中的氧化性DNA损伤高于非病理性黄韧带。基于这些发现，我们预测肥大黄韧带样品中过氧化氢酶基因表达的改变。过氧化氢酶在所有主要的身体器官中表达，尤其是肝脏，肾脏和红细胞，并且在细胞防御氧化应激中起重要作用。因此，我们假设缺乏过氧化氢酶，其催化过氧化氢进入水和氧气以保护生物免受自由基侵害，在黄韧带肥大中起作用。已知自由基会破坏细胞和组织［10］，导致许多组织的感染［11］，智力下降，免疫力下降［12］，关节疾病，心脏病［13］和纤维化。据我们所知，以前没有研究过氧化氢酶基因表达与黄韧带肥大之间的关联。

1 资料与方法

这项回顾性研究于2013年1月至2015年12月间在柳州市柳铁中心医院脊柱科诊所进行。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.1 一般资料 研究对象包括75例L4-L5水平LSCS减压性椎板切除术病人（LSCS组）和75例腰椎间盘突出症对照组（LDH组），磁共振成像（MRI）无黄韧带肥大的证据。排除标准是先前的腰椎间盘手术，椎骨骨折，任何感染迹象，糖尿病，肿瘤或任何恶性肿瘤。椎管＜10 mm被认为是椎管狭窄。所有手术均由本研究的笔者进行。笔者和1名熟练的放射科医师在矢状位和轴位T1和T2加权MRI上确认了LSCS和LDH。MRI在SIEMENSMR AEREA（1.5特斯拉）扫描仪上进行。

1.2 样品收集和黄韧带厚度的测量 在手术干预期间获得黄韧带样品，从所有病人获得了整个黄韧带样本层。从黄韧带样本中除去硬膜外脂肪，使用卡尺测量最厚点，精确到0.01 mm。在2个不同的点测量黄韧带厚度，并且使用最大厚度进行分析。

1.3 组织学分析 将每个样品的一半固定在4%中性甲醛中，并用20%乙二胺四乙酸脱钙4～6周。接下来，将样本包埋在石蜡中用于组织学分析。Masson三色染色用于评估纤维化程度，并且苏木精和伊红染色用于评估弹性蛋白降解。组织学分析由2位病理学家独立完成。

1.4 Masson三色染色 对黄韧带纤维化的严重程度进行分级：0级表示正常组织，1级表示整个区域纤维化＜25%，2级表示整个区域纤维化25%～50%，3级表示50%～75%纤维化，4级表示＞75%纤维化。

1.5 苏木精和伊红染色 对黄韧带弹性蛋白降解的程度进行分级：0级表示正常组织无弹力蛋白降解区，1级表示整个区域弹力蛋白降解率＜25%，2级表示25%至50%弹性蛋白降解，3级表示弹力蛋白降解50%～75%，4级表示弹力蛋白降解＞75%。

1.6 免疫组织学分析 对于免疫组织学染色，在切片机上切割连续切片，在二甲苯中脱蜡，并在醇溶液中再水合。接下来，在3 000 r/min时用胎牛血清对100 mg黄韧带组织进行匀浆（组织-Tearor，985370-04；BioSpec产品公司）。然后在裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mm乙二胺四乙酸，50 mm 氯化钠，0.02% 叠氮钠（NaN3），1%nonidet P-40，0.25 mm二硫苏糖醇）中裂解。在1 500转/秒，4℃下离心30 min后，获得上清液。为了分析每个样品，将30μg蛋白质加载到12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上。使用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒（Pierce BCA蛋白质测定试剂盒no 23225，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA；Pierce Company）测定裂解的黄韧带组织的蛋白质浓度。电泳后，使用转移缓冲液将蛋白质转移至150 V的聚偏二氟乙烯膜（Millipore，St Quentin，Yvelines，France）2 h。在将非特异性结合位点封闭过夜后，将膜与对过氧化氢酶特异的纯化兔多克隆抗体（兔抗过氧化氢酶；Cortex Biochem，CR2157RP，San Leandro，California）一起温育。对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）特异的小鼠抗体用作所有样品的蛋白质加载的内部对照［GAPDH抗体（0411）：sc-47724］。使用增强的化学发光（Amersham Life Sciences，Piscataway，NJ）使结果可视化。使用成像密度计GF670和分子分析软件（Bio-Rad，SAFCBioscience，Sigma-Aldrich）对每个样品3×量化印迹，并将平均值用作最终密度。密度表示为平均值±标准偏差（任意单位）。

1.7 统计学方法 分类变量表示为平均值和范围。Mann-WhitneyU检验用于评估两组之间黄韧带弹性蛋白降解程度，纤维化程度和平均光密度（OD）的差异。P＜0.05表示差异有统计学意义。使用SPSS 12.0版统计分析软件（SPSSInc，Chicago，IL）分析所有数据。

2 结果

2.1 两组一般情况比较 两组一般情况比较见表1，两组在年龄（P＝0.850）或性别（P＝0.751）方面差异无统计学意义。

2.2 黄韧带样品的厚度 在外科手术期间测量的平均黄韧带厚度在LSCS组中为5.99mm（范围为4.50～7.02 mm），在LDH组中为（2.95±0.6）mm，范围为1.98～3.2 mm。LSCS组的平均黄韧带厚度较高（5.99±0.86）mm，范围为4.5～7.02 mm，差异有统计学意义（P＝0.004）。

表1 腰椎管狭窄（LSCS）75例和腰椎间盘突出症（LDH）75例一般情况比较

2.3 弹性蛋白降解和黄韧带的纤维化 在LDH（对照）病人中，组织学图像显示丰富的正常弹性蛋白纤维以严格平行或规则的排列组织。相比之下，在LSCS病人中，弹性蛋白降解程度非常高，苏木精和伊红染色显示弹性纤维排列不规则。LSCS病人标本中弹性蛋白降解的平均等级高于LDH病人，（3.04±0.50）比（0.79±0.60），差异有统计学意义（t＝7.997，P＝0.007）。LSCS病人标本中平均纤维化分级高于LDH病人，（3.01±0.47）比（0.66±0.42），差异有统计学意义（t＝8.765，P＝0.005）

对病人组织进行的免疫组织化学研究显示，LDH组病人的组织中的阳性染色成纤维细胞显著低于LSCS组病人，（14.23±6.81）比（61.36±15.29），差异有统计学意义（t＝12.592，P＝0.001）。

2.4 过氧化氢酶表达 黄韧带细胞培养上清液的明胶酶谱显示LSCS病人样品中过氧化氢酶活性持续降低。在从LDH病人获得的黄韧带细胞培养物上清液中，观察到较高的过氧化氢酶活性，使用GAPDH进行标准化。LSCS组的OD为（61.80±31.10），LDH组的OD为（152.80±41.13）。LSCS组的平均OD值低于LDH组（t＝15.196，P＝0.009）。

3 讨论

黄韧带覆盖椎管的后壁和侧壁。随着黄韧带变厚，椎管开始变窄并且神经结构被困在管内［14］。在本研究中，手术期间进行的测量显示，LSCS病人的平均黄韧带厚度高于LDH病人。我们还证明了大多数肥大黄韧带样本区域存在不规则排列，破裂，肿胀和减少的弹性纤维以及纤维化增加。先前报道过黄韧带厚度，弹性丧失和纤维化评分之间的正相关关系［15］。我们的结果与之前的研究结果一致，我们加入对照组可以加强这些发现。

此外，我们试图确定哪些生化因子可能导致组织学变化和LSCS。已知过氧化氢酶在体内各种结缔组织中减少结构蛋白如胶原蛋白和血管生成素的分泌。以前的研究表明过氧化氢酶的过表达可以防止纤维化［16］。基于这些发现，我们假设缺乏过氧化氢酶可能在黄韧带肥大中发挥作用。在本研究中，我们观察到肥大黄韧带样品的血管周围区域中过氧化氢酶基因表达降低。众所周知，过氧化氢酶可保护细胞免受氧化应激［17］。过氧化氢酶活性的降低导致异常的上皮修复，上皮损伤与纤维化发展过程中过氧化氢酶的功能缺陷有关［18］。有报道称细胞外ROS增加基质沉积并导致细胞纤维化增加［14］。ROS也被称为反应性化学实体，广泛参与细胞信号传递、代谢、存活和凋亡，从而调节许多生理和病理过程，包括细胞生长、纤维化、收缩/扩张和炎症［20］。因此，我们的结果提示，缺乏过氧化氢酶，消除了ROS，可能参与了黄韧带肥大的机制，从而导致LSCS。这是关于过氧化氢酶和黄韧带肥大之间关系的第一项研究，可能提出了LSCS的新治疗策略。

本研究表明弹性蛋白降解和纤维化增加与黄韧带肥大密切相关，这与过去的研究一致。此外，我们报道了LSCS病人缺乏过氧化氢酶，这是一种抗氧化酶。我们希望这些新发现为未来的研究打开一扇门。