高效液相色谱法分析遵义引种的栝楼籽游离氨基酸含量

梁光平，杨俊，陈荣华，刘亮，丁丽娜，万路平，陈东林*

(1.遵义医药高等专科学校 药学系，贵州 遵义 563006；2.贵州省野生药用植物资源持续利用协同创新中心，贵州 遵义 563006；3.遵义市农业农村局，贵州 遵义 563000)

栝楼籽是葫芦科植物栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim)的成熟干燥种子，又称瓜蒌子、吊瓜子。性甘、寒，归肺、胃、大肠经，具有润肺化痰，滑肠通便的功效[1]。在江浙地区，炒熟的栝楼籽也作为休闲品尝的时尚礼品受到人们的喜爱，属于新兴的药食同源品种。由于栝楼籽资源需求量越来越大，本课题组前期从浙江绍兴引进5个品种的栝楼籽到贵州遵义进行育苗、栽培，并通过原产地与引种地栝楼籽所含药效成分、微量元素、重金属，以及总蛋白、多糖、脂肪等营养成分的分析，初步优选出其中的2号栝楼籽(越蒌2号)为适宜在贵州遵义栽培的品种[2-4]。为进一步探讨该品种在贵州遵义栽培的可行性，本研究在前期研究的基础上，对引种地越蒌2号及其原产地种子16种游离氨基酸的含量进行了分析比较。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

原产地越篓2号栝楼籽由浙江省绍兴市农业科学研究院提供，将该种子引种至贵州省遵义市，经过育苗、栽培、采收加工和干燥等工序即得引种地栝楼籽。

安捷伦公司16种氨基酸混合对照品，包括苯丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苏氨酸、甘氨酸、组氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸。异硫氰酸苯酯、三乙胺、乙腈、醋酸、正己烷等试剂均为分析纯，未经进一步纯化处理直接使用。

液相色谱系统(LC-2030，日本岛津公司)，超声波清洗仪(QTSXR10260，天津瑞普生物技术股份有限公司)，原位冷冻干燥机(SCIENTZ-100F，宁波新芝生物科技股份有限公司)，电子天平(ATY224，日本岛津公司)，超纯水仪(WP-UP-WF-30，四川沃特尔水处理设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 供试液的制备

游离氨基酸样品溶液的制备：精密称取引种地栝楼籽粉末1.0 g，加水20 mL浸泡2 h后，超声提取1 h，抽滤，滤液采用冷冻干燥法进行干燥，加水定容至10 mL备用。

样品衍生：参照文献[5]的方法并稍作修改，吸取样品1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，从中取500 μL稀释后置于具塞试管中，加入异硫氰酸苯酯的乙腈溶液250 μL，三乙胺-乙腈溶液250 μL，摇匀，室温放置1 h后，加入50 μL醋酸，摇匀。

萃取净化：向上述衍生后的溶液中加入1.0 mL正己烷，涡旋混合器振荡1 min，静置分层后，弃去上层正己烷溶液，重复此操作2次，合并下层溶液，用0.45 μm滤膜过滤，滤液用于液相色谱测定。

原产地栝楼籽和16种氨基酸混合对照品溶液按照相同的方法进行处理。以不加样品的溶液空白为对照。

1.2.2 色谱条件

PhenomenexTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相A(无水硫酸钠+三乙胺混合水溶液)与流动相B(甲醇-乙腈-水)根据文献[5]的方法进行配制。检测波长为254 nm，进样量10 μL，柱温30 ℃。

2 结果与分析

对引种地和原产地栝楼籽的氨基酸成分进行比较，结果如表1所示。2个样品都检测出了16种游离氨基酸，引种地与原产地栝楼籽游离氨基酸相对含量均超过5.0%的有脯氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸等7种，其中以脯氨酸的相对含量最高，均超过了30%。2种栝楼籽样品中16种氨基酸的相对含量基本一致。引种地栝楼籽必需氨基酸占总氨基酸的21.92%，原产地的占20.77%，两者百分比也基本接近。在引种地栝楼籽中，有13种游离氨基酸的含量高于原产地栝楼籽样品，丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸的含量低于原产地栝楼籽。其中，脯氨酸的相对含量降低最明显，下降了2.94百分点。

表1 引种地与原产地16种游离氨基酸含量

注：*为必需氨基酸，含量变化为引种地相对含量减去原产地相对含量。

3 小结

药用植物引种既保护了濒危植物，又确保了药用植物可持续利用，还在一定程度上解决了由于产地局限造成的资源紧张[6]。本文研究的栝楼籽是从浙江绍兴引种至贵州遵义，属跨域引种，该引种方式具有较强的探索性。同时也对引种研究者在评价引种药材质量方面提出了更高的要求。引种地栝楼籽16种游离氨基酸的相对含量与原产地栝楼籽的含量基本一致，说明在贵州遵义引种栽培的栝楼籽与原产地区的差异不明显，表明越蒌2号栝楼可以在贵州遵义地区进行大量栽培。