UPLC-MS/MS测定猪肉中4种氟喹诺酮残留量的不确定度评价

虞冰，刘莉，马婧妤，吾建祥，杨德毅，刁银军

(1.金华市农产品质量综合监督检测中心，浙江 金华 321017；2.金华职业技术学院，浙江 金华 321017)

氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones，FQs)是一类全合成广谱抗菌药，广泛应用于动物疾病预防与治疗[1-2]。FQs可通过食物链进入人体，对人体中枢神经系统和心血管系统造成不良影响。FQs在动物体内的残留问题已经引起广泛的关注，很多国家和组织将FQs列入限制使用名单中，并制订最高残留限量(maximum residue limit，MRL)[3-5]。

测量不确定度是判定检测结果数据的根本，同时也体现了实验室评定检测和校准水平。《校准和检测实验室能力的通用性要求》明确要求，“当不确定度与检测结果的有效性或应用有关，或客户的指令中有要求，或不确定度影响到限度的符合性时，检测报告中需包括有关不确定度的信息”。根据《中华人民共和国国家计量技术规范》《测量不确定度评定与表示》等要求，检测机构在食品安全性指标检测中需对测量结果的不确定度进行评估。本文根据国家计量技术规范技术要求及化学分析中不确定度的评估指南，建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定金华两头乌猪肉中4种氟喹诺酮残留量的方法，并对测定结果进行不确定度评价及分析，为金华两头乌猪肉品质评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

金华两头乌猪肉购自金华市两头乌养殖基地；依诺沙星(纯度为99.3%)、氧氟沙星(纯度为99.30%)、诺氟沙星(纯度为99.10%)、培氟沙星(纯度为99.00%)标准品，购自北京振翔科技有限公司；无水硫酸钠、正己烷均为分析纯；乙腈、甲酸为色谱纯。

LC-MS/MS8050超高效液相色谱-串联质谱仪，日本岛津公司；CF6RN高速离心机，日本Hitachi公司；BSA2202S电子天平，德国赛多利斯公司；T25涡旋振荡器，德国IKA公司；N-EVAP氮吹仪，美国Organomation公司；HY-4调速多用振荡器，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；旋转蒸发仪，德国Heidolph公司。

1.2 标准溶液配制

称取氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星各10.00 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容溶解，各吸取1 mL至25 mL容量瓶中，配制成40 μg·mL-1氟喹诺酮类兽药混和标准溶液储备液，倍比稀释至100 ng·mL-1氟喹诺酮类混标溶液。

1.3 样品前处理

称取已匀浆两头乌猪肉样品2.00 g于50 mL离心管中，加入2 g无水硫酸钠，振荡1 min，再加入4 mL酸化的乙腈(乙腈∶甲酸99∶1)溶液，涡旋混匀，超声3 min，4 ℃、4 000 r·min-1离心5 min，将上清液转移至50 mL离心管中，用4 mL酸化乙腈重复提取1次，提取液合并至离心管中定容。提取液中加入10 mL乙腈饱和正己烷溶液，振荡5 min，弃去上层正己烷，重复净化1次，氮气吹干后，加入1 mL乙腈溶解，加入1 mL水，超声30 s，涡旋混匀，取1 mL定容液，4 ℃、14 000 r·min-1离心5 min，过0.22 μm滤膜至进样瓶中，UPLC-MS/MS测定。

1.4 UPLC-MS/MS分析

1.4.1 超高效液相色谱条件

色谱柱：Shim-pack GISS柱，1.9 μm，2.1 mm×100 mm；流动相A：0.2%甲酸水溶液，流动相B：乙腈/甲醇溶液(6∶4)；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：1 μL；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱条件见表1。

表1 超高效液相色谱流动相洗脱条件

1.4.2 质谱条件

离子化模式：ESI(+)；源温度：300 ℃；DL温度：250 ℃；加热气：空气，流速10.0 L·min-1；加热模块温度：400 ℃；雾化气：氮气，流速3.0 L·min-1；扫描模式：多反应监测(MRM)；干燥气：氮气，流速10.0 L·min-1；延迟时间：3 ms；碰撞气：氩气。氟喹诺酮类兽药检测离子对、碰撞能参数见表2。

表2 4种氟喹诺酮类兽药定性定量离子参数

2 结果与分析

2.1 建立不确定度数学模型

配制一系列浓度梯度的标准溶液，绘制标准曲线。

根据标准溶液测定样品溶液的浓度，建立测定样品中喹诺酮类药物残留量的数学模型：

X=1 000cV/(1 000×m)。

(1)

式中：X指样品中待测组分的含量(μg·kg-1)，c指测定液中待测组分的浓度(ng·mL-1)，V指定容体积(mL)，m指样品称样量(g)。

2.2 不确定度的主要来源

不确定度来源主要包括标准溶液配制引入的不确定度、标准拟合曲线引入的不确定度、样品测定引入的不确定度3大类(图1)。

图1 UPLC-MS/MS测定氟喹诺酮残留量的不确定度来源

2.3 标准溶液制备引入的不确定度urel(p)

2.3.1 标准品纯度及称量引入的不确定度urel(p1)

c指氟喹诺酮标准品的纯度，标准品纯度引入的相对不确定度计算公式为：

(2)

称取标准品时，根据JJG 1306—2008《电子天平检定规程》，天平允许的最大误差为±0.05 mg，准确称取氟喹诺酮标准样品各10.00 mg，按均匀分布，称量引入的相对不确定度为：

(3)

式中，m为标准品的称量质量。标准品纯度及称量引入的不确定度见表3。

表3 标准品纯度及称量引入的不确定度

2.3.2 标准品定容引入的不确定度urel(p2)

根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》，10 mL容量瓶(A)级容量允差为±0.02 mL，按照均匀分布；同时，20 ℃时甲醇的热膨胀系数为0.001 2，假设室温偏差控制在±5 ℃，按照均匀分布。经计算，氟喹诺酮类兽药标准品定容引入的不确定度urel(p2)为0.115 6。

合成标准品纯度及称量引入的不确定度urel(p1)和标准品定容引入的不确定度urel(p2)，氟喹诺酮类兽药标准溶液制备引入的不确定度urel(p)见表4。

表4 标准溶液制备引入的不确定度

2.4 标准拟合曲线引入的不确定度urel(s)

2.4.1 标准品定容引入的不确定度urel(s1)

使用A级吸量管分别准确吸取2、5、8、10、20、50 mL标准溶液于A级100 mL单标容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度线，所得浓度依次为2、5、8、10、20、50 ng·mL-1的标准系列溶液。根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》，A级100 mL单标容量瓶容量允差为±0.1 mL，A级10 mL吸量管的容量允差为±0.02 mL，按照均匀分布。20 ℃时甲醇的热膨胀系数为0.001 2，假设室温偏差控制在±5 ℃，按照均匀分布。氟喹诺酮标准系列溶液的配制过程中引入的不确定度见表5，经合成，标准系列溶液的配制引入的不确定度urel(s1)为0.007 02。

表5 标准系列溶液的配制过程引入的不确定度

2.4.2 拟合曲线引入的不确定度urel(s2)

取以上对应质量浓度为2、4、6、8、10 ng·mL-1的6种标准系列溶液各1 μL分别测定，得到相应的色谱峰面积Ai，用Excel拟合而成的线性回归方程为Ai=aCi+b。式中，a为斜率，b为截距。根据公式：

(4)

式中，SR指标准溶液峰面积残差的标准差，p指试样平行测量次数，n指拟合曲线的数据总数，C平指标准溶液的平均质量浓度，C0指待测样品溶液按回归方程计算得到的浓度平均值。

SR计算方法为：

(5)

式中，n为测定次数。

本实验中，拟合曲线的数据总数n=6，样品测定次数p=3，经合成，氟喹诺酮标准溶液拟合曲线引入的不确定度见表6。

表6 标准曲线拟合曲线引入的不确定度

2.5 样品测定引入的不确定度urel(y)

2.5.1 样品称量引入的相对不确定度urel(y1)

准确称取2.00 g样品，根据JJG 1306—2008《电子天平检定规程》的要求，天平允许的最大误差为±0.001 g，准确称取4种标准品，按均匀分布，样品称量引入的相对不确定度为urel(y1)=0.000 204。

2.5.2 仪器进样体积引入的相对不确定度urel(y2)

样品上机进样量为1 μL，微量注射器体积的相对标准偏差(RSD)为±1%，符合对称分布，则仪器进样体积引入的相对不确定度urel(y2)=0.004 082。

2.5.3 样品重复性测定引入的相对不确定度urel(y3)

金华两头乌猪肉阳性样品测定T1=10，阳性样品的不确定度计算公式为：

(6)

式中，r为阳性样品的平均值，Sr为标准偏差。阳性样品重复测量引入的相对不确定度见表7。

表7 阳性样品重复性测定引入的不确定度

2.5.4 样品添加回收引入的相对不确定度urel(y4)

在空白猪肉试样中添加20 μg·kg-1的4种氟喹诺酮混合标准溶液，平行测定5次(T2)，根据平均回收率(z)，样品添加回收引入的不确定度计算公式为：

(7)

式中，Srs为回收率标准偏差。样品添加回收引入的相对不确定度见表8。

表8 4种氟喹诺酮加标回收引入的不确定度

综上，样品测定引入的不确定度urel(y)计算公式为：

(8)

根据公式，计算样品测定引入的不确定度urel(y)(表9)。

表9 样品测定引入的不确定度

2.6 合成不确定度urel

金华两头乌猪肉中4种氟喹诺酮药物残留量测定的合成不确定度计算：

(9)

经计算，金华两头乌猪肉中氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星残留量测定的合成不确定度urel分别为0.014 746 04、0.033 331 02、0.044 333 34、0.038 937 93。

2.7 扩展不确定度u

对于大多数测量采用包含因子k=2衡量，则金华两头乌猪肉中氟喹诺酮含量的扩展不确定度公式为：

u=urel×2×C。

(10)

式中C为阳性样品氟喹诺酮含量。

由此得到UPLC-MS/MS法测定中金华两头乌猪肉时，当金华两头乌猪肉中氧氟沙星的含量为15.20 μg·kg-1时，其扩展不确定度为0.450 μg·kg-1，k=2；当诺氟沙星的含量为19.32 μg·kg-1时，其扩展不确定度为1.291 μg·kg-1，k=2；当培氟沙星的含量为9.34 μg·kg-1时，其扩展不确定度为0.829 μg·kg-1，k=2；当依诺沙星的含量为16.34 μg·kg-1时，其扩展不确定度为1.275 μg·kg-1，k=2。

3 讨论

在金华两头乌猪肉氟喹诺酮含量分析过程中，标准溶液配制、样品称量、样品检测、加标回收等过程均会引入不确定度，加标回收率和标准曲线拟合过程中不确定度较大。为了减少金华两头乌猪肉中氟喹诺酮测定结果的误差，可通过增加混合标准系列溶液的测定次数，增加平行样品测定，保持气相色谱仪器较高的灵敏度，并定期对所涉仪器进行检定和提高操作人员的熟练水平，来减小测量不确定度，从而保证检测结果的准确性。