柚皮素磷脂复合物对实验性脉络膜新生血管NF-κB/iNOS 通路的影响

吉洁，徐新荣，周春刚，唐苗苗，唐颖，王荣荣，王科蕾

脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是较为常见的眼底病变，CNV 的发病因素较为复杂，可能与Bruch’s 膜的损伤、视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞外基质变化、炎症反应和氧化应激密切相关[1]。目前关于CNV 的形成机制对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的研究较多[2]。近年来研究表明，核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB)在新生血管形成中具有重要作用，其可调控多种基因的转录，包括血管形成因子、黏附因子等细胞因子[3]。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）与新生血管的形成具有密切的联系，而iNOS 表达的机制是通过抑制NF-κB 的活化抑制iNOS 的转录水平[4]。目前对CNV 的治疗主要是糖皮质激素和VEGF 拮抗剂，但这两类药物存在高风险和治疗费用昂贵等限制，因此寻找治疗CNV 的药物具有重要临床意义。关于许多中药单体能明显抑制眼新生血管生成已有许多相关报道[5]。柚皮素（naringenin，Nar）是二氢黄酮类植物提取物，具有抑制iNOS、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表达的作用，但其水溶性差，生物利用率低[6]。故本研究采用柚皮素磷脂复合物（naringin phospholipid complex，NPC）治疗CNV 大鼠，探究其对CNV 大鼠NF-κB/iNOS 通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 清洁级健康雄性Brown-Norway 大鼠72 只购自北京维通利华动物技术有限公司[SCXK（京）2015-0012]，体重200～220 g，严格按照饲养规则喂养大鼠，室内保持通风，温度25℃，湿度50%，光照时间为12 h（8：00～20:00），大鼠自由饮用蒸馏水，饲养期间保持饲养房间整洁。

1.2 仪器与试剂

柚皮素（北京百灵威科技有限公司）纯度＞98%，大豆磷脂（上海浦江磷脂厂），基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）（SIGMA 公司）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）（SIGMA公司）、人单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6（interleukin-6，IL-6)ELISA 试剂盒（美国Abcam 公司），NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF 兔抗鼠一抗（美国R&D 公司）；HRP 标记的羊抗兔IgG 二抗、β-actin（北京博奥森生物技术有限公司），RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒（Takara 公司）；蛋白酶抑制剂（北京索莱宝科技有限公司），RIPA 裂解液、BCA 测定试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；多波长氪激光机（美国Lumenis 医疗激光公司）；X 射线衍射仪（瑞士ARL 公司）；荧光定量PCR 仪（美国BioRed 公司）；光学显微镜（德国Carl Zeiss）；凝胶成像仪（购自于美国GE公司）；ImageJ 软件（USANationalInstitutes of Health）。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠SAH 模型制备 大鼠在造模前禁食12 h，腹腔注射10% 水合氯醛（0.3 ml/kg）麻醉动物，用0.5%托吡卡胺与新福林混合散瞳剂充分散瞳孔，采用氪黄激光（波长568 nm，参数：光斑直径100 μm，曝光时间0.1 s,功率150～200 mW，在120 D 专用前置镜下，距视盘2～4 个视盘直径，围绕视盘在视网膜大血管间光凝8 个点，光凝后待Bruch’s 膜被击破后产生小气泡视为合格光凝点，将视网膜、脉络膜或玻璃体出血大鼠剔除，造模成功大鼠麻醉苏醒后送回SPF 饲养箱。

1.3.2 药品制备 柚皮素（Nar）溶于无水乙醇中，加温至60℃，按照1:2 的质量比加入大豆磷脂搅拌均匀成溶液状态，过滤溶液，滤液经冷冻干燥机干燥24 h 的柚皮素磷脂复合物（NPC）。

1.3.3 实验分组及给药 模型大鼠随机分为空白对照组12 只，溶媒对照组12 只、Nar 治疗组12 只、NPC治疗组36 只（分高、中、低三个浓度组），Nar 治疗组给药剂量：20 mg/kg/d，NPC 治疗组按高、中、低3 个剂量（10、20、30 mg/kg/d）分别给药；溶媒对照组给Nar治疗组药液等体积二甲基亚砜（DMSO）。均为腹腔注射。视网膜光凝后当天开始给药至观察结束。

1.4 观察指标

1.4.1 眼底检查和分析 于大鼠激光治疗4 周后行眼底荧光造影（fundus fluorescein angiography，FFA），每组12 只大鼠进行麻醉、散瞳孔，舌下静脉注射0.3ml的100 g/L 的荧光素钠进行眼底血管荧光造影检查，立即开始双眼摄片，观察15 min，观察CNV 形成情况，并计算荧光素渗漏点数占总光凝点数的百分率，评估CNV 的形成率。CNV 的评判标准：光凝点早期低荧光、晚期荧光素渗漏范围扩大为1 级，光凝点早期强荧光、晚期荧光素渗漏范围扩大为2 级。

1.4.2 脉络膜铺片荧光显微镜观察 给药治疗4 周后，每组取6 只大鼠进行舌下静脉注射异硫氰酸葡聚糖(FITC-D)（0.2 ml/只），100 mg FITC-D 溶于1 ml的PBS 缓冲液中。灌注完成30 min 后摘除大鼠眼球于4%的多聚甲醛溶液中固定1 h；显微镜下沿赤道部打开眼球，去除前节，揭除视网膜神经上皮层，获得视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体标本，以视神经为中心做4～6 个放射状切口，常规梯度进行乙醇脱水、二甲苯透明，随后将RPE 面向下置于盖玻片上，封片、烤片。标本置于荧光显微镜光镜下观察、拍片并使用Image J 软件进行图像分析。

1.4.3 RT-qPCR 检测NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表达 参照RNA 提取试剂盒说明书提取眼后节组织（视网膜神经上皮、RPE、脉络膜复合物）总RNA，组织匀浆快速抽提，测定RNA的浓度和纯度；参照反转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA，进行RT-qPCR。RT-qPCR 反应体系：10×cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.5μL，H208μL，2×SYBR Mix 10 μL；RT-qPCR 反应程序为95℃×3min，95℃×10s、60℃×30s，72℃×2 min，40 个循环，72℃延伸10 min。RT-PCR 引物由上海生工生物合成，序列如表1。反应结束后收集数据，以β-actin 作为内参基因，按照2-ΔΔCt算法进行相对定量分析。

1.4.4 Westernblot 检测NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表达 取出超低温冰箱保存的眼后节组织100 mg，加入1 ml RIPA 裂解液裂解组织，冰上放置30 min，振荡离心后收集上清液，提取总蛋白；BCA 法测定蛋白浓度，记录562 nm 处吸光值，绘制标准曲线，计算样品浓度，变性蛋白；配制浓度为12%分离胶、5%浓缩胶，蛋白上样量为50 μg，电压设定在100 V 电泳，电泳完成后蛋白凝胶转膜至PVDF 膜，用TBST 溶液清洗后5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，TBST 溶液清洗后，加入一抗，4℃过夜，TBST 洗膜3 次/5 min；TBST 清洗后加入二抗，室温下孵育1 h，洗膜3 次/5 min，TBST 清洗后置于凝胶成像仪中ECL 显影液显影，观察各组蛋白变化情况。以β-Actin 为内参进行灰度值比较。

表1 RT-PCR 引物序列

1.5 统计学方法

采用统计学软件SPSS 21.0 进行数据分析。计量资料以平均数±标准差描述，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用方差分析中LSD-t 检验。计数资料采用χ2检验。当P＜0.05 时，则认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NPC 对大鼠FFA 检测结果的影响

健康BN 大鼠视网膜血管呈放射状行走，光凝后可见明显瘢痕，空白对照组，溶媒组显示有强荧光渗漏，荧光素渗透面积分别扩大180 点、175 点，占总光凝数192 点的93.75%、91.14%；Nar 组荧光信号减弱，渗透范围扩大161 点，占总光凝点数的83.8%，与空白对照组相比CNV 形成率差异有统计学意义（χ2=9.454，P=0.000）；NPC 低、中、高剂量组较空白对照组荧光信号显著减弱，渗透范围分别为143 点、120 点、105 点，分别占总光凝数的74.47%、62.5%、54.68%，光凝4 周后CNV 形成率差异均有统计学意义（χ2=26.681、54.857、76.555，均P=0.000）。

2.2 NPC 对大鼠CNV 面积的影响

脉络膜铺片荧光显微镜观察造模后视乳头周围的光凝点与周围的脉络膜比较呈网状高荧光斑，新生血管形成。由表结合图片可见，光凝4 周后各组视网膜均可见CNV，表示造模成功。空白对照组、溶媒组新生血管面积最大（图1A，1B），两组之间无统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组相比，Nar 组和NPC组CNV 面积明显减少，差异有统计学意义（tnar=15.165，tNPC低=21.411，tNPC中=29.815，tNPC高=34.129，均P=0.000）；NPC 低、中、高三组组间比较总体差异有统计学意义（F=35.117，P=0.000）。高剂量组CNV 面积显著小于低、中剂量组（tNPC低=8.275，PNPC低=0.000；tNPC中=3.529，PNPC中=0.002）。与Nar 组相比，NPC 低、中、高剂量组CNV 面积明显减少（tNPC低=8.824，tNPC中=13.920，tNPC高=17.724，均P=0.000）。

图1 大鼠FFA 检测结果。1A 空白对照组；1B 溶媒组；1C Nar 组；1D NPC 低剂量组；1E NPC 中剂量组；1F NPC 高剂量组

2.3 NPC 对NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表达的影响

与空白对照组相比，溶媒组NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表达水平均无统计学意义（均P>0.05）；Nar 组COX-2、MMP-2、MMP-9mRNA表达水平与空白组相比有统计学意义（tcox-2=10.824，tMMP-2=6.346，tMMP-9=14.710；均P=0.000）；NPC 低、中、高剂量三组组间在NF-κB、COX-2、VEGF mRNA 有统计学意义（FNF-κB=95.681，Fcox-2=65.732，FVEGF=86.90，均P=0.000），NPC低剂量组NF-κB、iNOS、COX -2、VEGF、MMP-2、MMP-9 mRNA 表达水平均较Nar 组降低（tNF-κB=9.824，tiNOS=6.824，tcox-2=9.357，tVEGF=5.824，tMMP-2=5.914，tMMP-9=4.560；均P=0.000），NPC 高剂量组NF-κB、VEGF mRNA 表达水平较低剂量组降低（tNF-κB=35.461，tVEGF=28.175，均P=0.000）。

图2 大鼠CNV 面积的检测。2A 空白对照组；2B 溶媒组；2C Nar组；2D NPC 低剂量组；2E NPC 中剂量组；2F NPC 高剂量组

表2 不同药物处理后大鼠视网膜CNV 面积（×103μm2，n=6）

图3 大鼠各基因mRNA 检测结果。3A NF-κB；3B iNOS；3C COX-2；3D VEGF；3E MMP-2；3F MMP-9。1 空白对照组；2 溶媒组；3 Nar 组；4 NPC低剂量组；5 NPC 中剂量组；6 NPC 高剂量组。a 与空白对照组比较，P＜0.05；b 与Nar 组比较，P＜0.05；c与NPC 低剂量比较，P＜0.05

2.4 NPC 对NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表达的影响

与空白对照组相比，溶媒组NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平两组间均无统计学意义（均P>0.05）；Nar 组6 种指标蛋白表达水平与空白组相比有统计学意义（tNF-κB=4.261，tiNOS=4.750，tcox-2=3.824，tVEGF=5.432，tMMP-2=3.376，tMMP-9=10.722；均P=0.000）；柚皮素磷脂复合物组低剂量组iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平与柚皮素组相比有统计学意义（tiNOS=12.117，tcox-2=3.227，tVEGF=5.972，tMMP-2=3.631，tMMP-9=4.932；均P=0.000），柚皮素磷脂复合物高剂量组COX-2、VEGF 蛋白表达水平较中剂量组降低（tcox-2=10.753，tVEGF=6.148，均P=0.000），有统计学意义。

图4 Western blot 检测NF-κB、iNOS、COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表达。1 空白对照组；2 溶媒组；3 Nar 组；4 NPC 低剂量组；5 NPC 中剂量组；6 NPC 高剂量组

表3 大鼠NF-κB/iNOS 通路相关因子蛋白检测结果（±s，n=3）

表3 大鼠NF-κB/iNOS 通路相关因子蛋白检测结果（±s，n=3）

注：a 与溶媒组比较，P＜0.05；b 与Nar 组比较P＜0.05；c 与NPC 低剂量组比，P＜0.05；d 与NPC 中剂量组比较，P＜0.05

3 讨论

柚皮素是广泛存在于橘子、胡柚皮、柠檬、枳壳中的黄酮类物质，其结构决定了其在水中的溶解度较低，生物利用率低。研究报道天然黄酮类物质与磷脂具有特殊的亲和力，可在一定条件下形成复合物，并能增强母体的生物、药理活性[7-8]。银杏黄酮磷脂复合物以DMSO 为溶媒可显著提高银杏黄酮的溶解度，提高其对动脉粥样硬化形成的抑制作用[9]。双氯芬酸与磷脂形成复合物后在正辛烷-水中的分配系数高了约1 倍。淫羊藿黄酮磷脂复合物在正辛烷-水中的分配系数是药物自身的4 倍，可显著提高药物生物利用度[10]。葛根素磷脂复合物的体外透皮渗透实验中发现葛根素磷脂的复合物的1 h 渗透量显著高于葛根素[11]。本研究采用腹腔注射柚皮素和柚皮素磷脂复合物改善CNV 大鼠脉络膜新生血管生成情况，研究结果显示柚皮素磷脂复合物治疗组的CNV 面积和荧光渗透较柚皮素组均显著降低，表明柚皮素磷脂复合物的生物活性较柚皮素显著提高，可抑制CNV 的生成。

NF-κB 是生物体内广泛存在的转录因子，其在血管形成中发挥核心调节作用。NF-κB 在视网膜缺氧状态时表达于视网膜内核层的胶质细胞和内皮细胞核中[12]。年龄相关性黄斑病变和缺血性视网膜病变患者的CNV 均是由缺氧引起[13-15]。NF-κB 在CNV组织的巨噬细胞、血管内皮细胞等视网膜颗粒层组织中表达增加[16]。NO 可促进内皮细胞的增生、迁移，增加血管的通透性，其在体内由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化合成[17]。NOS 中的iNOS 与多种病理过程相关，NF-κB 活性增加可促使iNOS活性升高。iNOS 活性增高可在转录水平上诱导VEGF 的表达，调控血管生成[18]。COX-2 是与炎症反应密切相关的酶，其是VEGF 的上游因子之一，调控眼组织新生血管的形成[19]。敲除小鼠COX-2 基因，可以抑制氪激光诱导的CNV 中VEGF 的表达下调，这可能与MMPs 途径的活性降低、VEGF-MMPs 系统受到抑制相关[20]。MMPs 在炎性细胞和神经细胞中活性增高或者异常高表达，引起炎性细胞浸润、血脑屏障损伤等[21]。MMP-2 和MMP-9 参与基质降解、内皮细胞的移行，是CNV 形成、发展必不可少的因素。转化生长因子-β 多肽抑制物可下调VEGF、COX-2、MMP-2、MMP-9 的表达抑制CNV 形成[22]。

本研究发现，柚皮素及柚皮素磷脂复合物治疗组 可 下 调NF-κB、iNOS、VEGF、COX -2、MMP -2、MMP-9 的表达，抑制新生血管的形成、减少CNV 面积和荧光渗透。研究显示，柚皮素能够降低NF-κB、COX-2、iNOS 的活性，下调VEGF 的表达，抑制新生血管的形成。推测柚皮素可能是利用其抗炎作用，下调NF-κB、COX-2 的活性，抑制iNOS、VEGF、MMPs 的表达，进而抑制CNV 的形成。而柚皮素磷脂复合物治疗组对NF-κB、iNOS、VEGF、COX-2、MMP-2、MMP-9表达的抑制作用优于柚皮素组，柚皮素磷脂复合物治疗组CNV 面积和荧光渗透显著低于柚皮素治疗组，提示可能是磷脂复合物改变柚皮素的生物利用度，增强了其对各组酶和细胞因子的抑制作用。

综上所述，柚皮素磷脂复合物可抑制氪激光诱导的CNV 的形成，其可能通过NF-κB/iNOS 通路发挥作用。但本研究尚存在不足之处，对NF-κB/iNOS通路影响CNV 形成的具体作用机制未详细探究。今后需将柚皮素磷脂复合物和抗VEGF 药物进行对照研究，对柚皮素磷脂复合物的抑制脉络膜新生血管作用会产生更加明确的意义。