丹皮酚对食管癌细胞放射增敏作用及其机制

余定玥，郭加友，冯 琛，马志宇，郭嘉漪，马建新

食管癌是消化道常见的恶性肿瘤。全球每年新增食管癌40余万，包括2种主要组织学亚型：食管鳞癌和食管腺癌。我国为食管鳞癌的高发地区。早期食管鳞癌病人优先选择外科手术治疗，然而，食管癌的早期往往是非特异性的，大多数病人不重视本病，延误病情，丧失了手术切除的机会。因此放射治疗被广泛应用于中晚期食管癌病人中，尤其是食管鳞癌[1]。然而食管癌细胞对放射治疗为中度敏感，除食管癌的分期分型外，放射抗性也是局部复发和转移的主要原因之一[2]。因此寻找高效安全、优质价廉的药物，用来增加肿瘤组织细胞的放射敏感性有着十分重要的临床意义。丹皮酚是徐长卿粉末和牡丹皮，在中药提取为一种小分子酚类化合物，白色针状样晶体，化学名称为2-羟基-4-甲氧基苯乙酮，相对分子质量为166，分子式为C9H10O3。丹皮酚味苦、辛，熔点较低(51～52 ℃)，微溶于水，溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚、丙酮、苯和二硫化碳等有机溶剂[3]。近些年大量研究[4-6]均表明，在肝癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌等体内外细胞实验中，丹皮酚可通过多种机制发挥抗肿瘤作用，既有诱导肿瘤细胞凋亡、调控细胞周期，又有影响肿瘤血管生成、促进机体白细胞介素(IL)-2及肿瘤坏死因子α(TNF-α)生成的作用，以此发挥明显抗癌效应的作用。因此本研究以食管鳞癌细胞株KYSE450和TE10为研究对象，探讨丹皮酚对食管癌放射敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂 丹皮酚(Sigma公司)以二甲基亚砜(DMSO)为原料，4 ℃储存在冰箱中。用RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)稀释成工作液。工作液中DMSO(美国Sigma公司)的最终浓度≤0.1%。胎牛血清、胰蛋白酶购自GIBCO公司，细胞增殖毒性试验(CCK8)试剂盒、蛋白提取试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、GAPDH抗体购自CST公司。流式细胞术(FCM)是美国BD公司的产品，化学发光仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 细胞培养及处理 人类食管癌细胞株KYSE450、TE10购于上海细胞所。在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中培养细胞。细胞在37 ℃和5%CO2培养箱中每隔2～3 d传代培养。

1.3 细胞照射(IR) 采用瑞典Elekta医用直线加速器6 MV-X，将细胞培养皿放在1 cm厚有机玻璃板上，源皮距为100 cm，框架角度为180°照射，每分钟剂量率为450 cGy。

1.4 CCK8实验 收集对数生长期细胞，胰酶消化并按4×103个细胞/孔的密度接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2的细胞孵箱中继续培养。24 h后将丹皮酚按浓度梯度20、40、80、160、320 mg/L加入96孔板中，每个浓度设置5个复孔，同时设置对照组(不含丹皮酚，含等量培养基)，继续培养24、48 h。避光加入CCK8检测液(由CCK8原液与空白培养基1∶10配置)，每组设置一个空白组(不含细胞，只含CCK8检测液)，继续在5% CO2孵箱中37 ℃培养2 h，然后用酶标仪检测各组细胞的450 nm吸光度(A)。采用细胞存活率=(加药组值-空白组)/(对照组值-空白组)×100%方式计算细胞存活率。实验重复3次，绘制药物浓度-效应曲线，以平均值、药物浓度为横坐标、存活分数为纵坐标，并计算半数最大抑制浓度(IC50)。

1.5 克隆形成实验 收集对数生长期细胞，胰蛋白酶消化并计数。依照每块6孔板接受的不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)分别接种相应的细胞数(300、600、1 200、3 000、6 000个/孔)，置入37 ℃、5% CO2的细胞孵箱中过夜培养，然后加入40 mg/L、100 mg/L的丹皮酚工作液，将细胞分组为：对照组、40 mg/L丹皮酚组和100 mg/L丹皮酚组，每组均设置3个复孔。继续培养24 h后进行照射。X射线照射后4 h更换培养基，继续培养10～14 d肉眼可见克隆后收获细胞。弃去培养基，加入1 mL PBS清洗2次后，加入1 mL多聚甲醛固定15 min，再加入双蒸水清洗干净后加入1%结晶紫染色30 min。再次双蒸水清洗干净。在处理过程中动作轻柔，切勿损伤细胞克隆。6孔板室温下风干后在显微镜下计数克隆(≥50细胞)个数。

1.6 Annexin V-FITC/PI双染法和流式细胞术 取对数生长期的食管癌细胞株KYSE450和TE10细胞，用胰蛋白酶消化，按1×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中。将种植好的6孔板按照以下分组：对照组、40 mg/L丹皮酚组和100 mg/L丹皮酚组。同时设立3个复孔。过夜培养后，吸净6孔板内原有的培养基，按照分组分别加入含有浓度为40 mg/L、100 mg/L的丹皮酚工作液。处理后放入细胞培养箱内过夜培养。24 h后，予以8 Gy的X射线照射。照射后，将细胞放入细胞孵箱中，继续稳定培养。48 h后收集细胞上清及胰酶消化所有细胞放入编号相应的离心管内。离心，用PBS轻柔吹洗2～3次。将收集到的细胞转入细胞流式管，离心弃上清后每管加入300 μL的结合缓冲液，再加入FITC标记的Annexin-V(20 μg/mL)10 μL，而后加入PI(50 μg/mL)5 μL，轻柔混匀后避光反应15 min后上机检测。1 h内结束所有的细胞标本检测。

1.7 Western blotting实验 实验按要求分组，每次处理后根据蛋白提取试剂盒的指示提取总蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度并配平，加入5×上样缓冲液混匀，煮沸约5 min。每泳道加入20 μL样品，SDS-PAGE电泳后将蛋白转印至PVDF膜，用10%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗涤3次，每次10～15 min，一抗(Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、GAPDH抗体均按1∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜)，然后TBST洗涤3次，每次10～15 min。用1∶2 000稀释的抗兔抗体和抗鼠抗体在摇瓶中孵育1 h后，用TBST洗涤3次，每次洗涤10～15 min，而后利用增强化学发光(ECL)试剂盒显影。

1.8 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 丹皮酚抑制食管癌细胞的增殖活性 CCK8实验表明丹皮酚对于食管鳞癌细胞具有显著的药物毒性，它能够抑制食管鳞癌的增殖活性，其作用是剂量依赖性的(P<0.05～P<0.01)(见表1)。丹皮酚作用细胞24 h后，其在KYSE450和TE10细胞中的IC50分别为104.48 mg/L和207.87 mg/L。因此，选择40 mg/L和100 mg/L浓度的丹皮酚应用于后续实验。

表1 CCK8实验检测食管癌细胞增殖活力(%；ni=12)

q检验：与空白组比较*P<0.05；与丹皮酚20 mg/L组比较#P<0.05；与丹皮酚40 mg/L组比较△P<0.05；与丹皮酚80 mg/L组比较◇P<0.05；与丹皮酚160 mg/L组比较□P<0.05

2.2 丹皮酚对人食管鳞癌细胞KYSE450和TE10克隆形成能力的影响 为了验证丹皮酚关于食管鳞癌细胞的放射治疗增敏作用，我们用不同浓度的丹皮酚处理食管鳞癌细胞。经过单击多靶模型处理后，丹皮酚抑制KYSE450细胞的克隆形成，并呈现出剂量依赖关系(见图1A)。应用单击多靶模型公式[SF=1-(1-e-D/D0)n]计算SF值。丹皮酚在TE10细胞的克隆形成实验中同样表现出显著差异(见图2B),放射治疗剂量在2 Gy时，40 mg/L或100 mg/L浓度的丹皮酚处理后的KYSE450细胞的存活率(SF2)分别为0.48和0.37(见表2)；同样处理后的TE10细胞的存活率(SF2)分别为0.48和0.35(32)。

表2 丹皮酚对于KYSE450细胞的放射治疗增敏作用

表3 丹皮酚对于TE10细胞的放射治疗增敏作用

2.3 丹皮酚联合X射线照射对于人食管癌细胞KYSE450和TE10细胞凋亡率影响 流式细胞仪检测丹皮酚或/和放射治疗(8 Gy)处理后的细胞凋亡率(见表4)。与丹皮酚、放射治疗单独处理组相比，KYSE450和TE10细胞的联合处理组凋亡率显著增加(见图2)。随着丹皮酚的给药剂量增加，两者联合作用的促凋亡作用更加明显(P<0.01)。结果表明，丹皮酚能提高食管鳞癌细胞的凋亡率，提高其放射治疗敏感性。

表4 流式细胞仪检测食管癌细胞凋亡率(%)

2.4 丹皮酚对于食管鳞癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响 为了探究丹皮酚的作用机制，本实验检测了凋亡相关蛋白的表达情况。比较不同处理措施后KYSE450和TE10两株细胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、PARP蛋白的表达情况。蛋白电泳实验表明在丹皮酚作用影响下，KYSE450和TE10细胞中促凋亡蛋白PARP、caspase-3、cleaved caspase-3和Bax的表达上调。相反，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达受到了抑制(见图3)。

3 讨论

食管癌是人类健康的一个重要威胁，尤其在我国食管癌的诊治主要受到病人无早期特异性症状的影响，导致延误病情，癌症发展，丧失手术医治时机。因此对于局部晚期的食管癌而言，放射治疗是无法手术的食管鳞癌病人的最佳选择。近年来发现，放射耐受是癌症病人预后不良的重要原因之一，因而寻找高效低毒的药物以提高肿瘤组织放射敏感性是目前各项研究工作的重点。

近年来各项实验研究发现，丹皮酚在肺癌、肝癌、食管癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中发挥抗肿瘤作用[5]。丁文秋等[7]发现，丹皮酚能够通过影响凋亡相关蛋白，促进肺癌小凋亡，抑制肺癌细胞增殖，而发挥抗肿瘤的作用。刘思涵[8]研究发现丹皮酚，能够抑制cox-2、Bcl-2和survivin的表达，从而起到抑制裸鼠体内食管癌细胞移植瘤的生长，并诱导凋亡作用的发生，最终发挥抗肿瘤作用。杨震等[9]实验表明，丹皮酚能够抑制体内外食管鳞癌细胞株ECA-109的增长，诱导其凋亡。本实验发现，丹皮酚对食管癌细胞株KYSE450和TE10具有抑制其增殖的作用。流式细胞术实验结果表明，丹皮酚提高放疗后细胞的凋亡率，从而起到放疗增敏的作用。

我们对凋亡相关蛋白进行了检测，证明了丹皮酚能够通过调控细胞凋亡，从而对食管癌细胞起到抗肿瘤及放疗增敏的作用。细胞凋亡是维持内环境稳态、调控机体发育及衰老的重要机制[10]。细胞凋亡和细胞增殖通常是动态平衡的，一旦各项机制导致细胞增殖和细胞凋亡失衡，就会导致疾病的发生，这也是各种恶性肿瘤发生发展的重要原因之一[11]。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的相互作用，影响着内源性线粒体途径相关的凋亡相关蛋白caspase-3的调控[12],从而影响下游分子PARP导致凋亡的发生[13]。在Western blotting实验中，我们检测到，与两种不同浓度的丹皮酚单纯加药组和单纯放疗组相比，Bcl-2在两种浓度的丹皮酚联合放疗组中均有不同程度的下调，同时促凋亡蛋白Bax、caspase-3、cleave caspase-3、PARP均表现为上调。因此我们可以认为，在丹皮酚的作用下，Bax/Bcl-2比率增加，激活caspase蛋白的裂解，从而直接上调PARP蛋白的表达，启动凋亡程序的发生，导致食管癌细胞的凋亡，起到放疗增敏，发挥抗肿瘤作用。

综上所述，本研究表明，丹皮酚体外食管癌细胞放疗增敏的机制可能与凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、cleave caspase-3和PARP有关。然而放疗增敏机制更为复杂，可能涉及到多个信号通路。尤其在动物实验中，丹皮酚的放疗增敏机制值得进一步的研究探讨。同时丹皮酚对凋亡相关蛋白的调控是否具有特异性，也值得深入的研究。