小鼠支气管肺泡干细胞的分离、鉴定与三维培养体系的构建

王淑艳，陈以文，于 雪 ，刘丹彤 ，盛春瑞 ，畅洪昇，李丽娜

支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cells，BASCSs)是一类位于终末细支气管和肺泡交界处的肺组织固有的干细胞，它对于支气管和肺泡的修复与再生具有十分重要的意义[1-2]。肺腺癌起源于BASCSs的恶性转化[3-6]，而在特发性肺纤维化中，肺组织中的BASCSs数量下降[7]。BASCSs的研究对于揭示肺纤维化和肺癌的发病机制具有十分重要的意义[8-9]。本研究拟建立BASCSs的纯化与体外三维培养体系,为进一步研究BASCSs的相关特性奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 仪器：CO2细胞培养箱(Thermo，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；流式细胞仪(FACSCanto II，美国BD公司)。试剂：DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)，DMEM(高糖)培养基、胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)，Elastase (美国Worthington Biochemical公司)，0.2 mmol/L EGTA-1×PBS、1×PBS、1×HBSS+、DNase (200 U/mL)、2.5 g/L胰酶-EDTA、Matrigel (美国BD公司)，7-Aminoactinomycin D(7-AAD)、CD45-biotin、CD31-biotin、CD34-biotin、APC eFluor 780-streptavidin (美国eBioscience公司)，Insulin/transferrin/selenium(ITS) (美国Invitrogen公司)，Sca-1-AlexaFluor 647、EpCAM-PE-Cy7 (美国Biolegend公司)，SB431542(美国Ascent Scientific LLC公司)，小鼠肺成纤维细胞Mlg2908(美国ATCC)，12孔Transwell小室(美国Becton公司)。实验动物：健康雄性C57BL6小鼠[斯贝福(北京)生物技术有限公司提供]，体质量18～20 g，清洁级，实验过程按照《关于善待实验动物的指导性意见》处理实验动物[10]。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠支气管干细胞的体外分离与鉴定[11-15](1)小鼠用100 g/L水合氯醛腹腔麻醉，75%乙醇消毒，在超净台中剪开腹腔，腹主动脉放血处死。剪开胸腔，注意保持肺脏完整。(2)剪开下腔静脉，向右心室内注射10 mL的1×PBS，以冲洗肺脏血管。(3)气管插管，以0.2 mmol/L EGTA-1×PBS 1 mL进行肺泡灌洗，重复4次。小心取出心脏和肺脏，注意保持肺脏完整。(4)经气管向肺内注入1 mL Elastase(4 U/mL)，37 ℃孵育5 min。然后经气管向肺内注入0.5 mL Elastase(4 U/mL)，37 ℃孵育5 min，重复4次(共注入肺脏3 mL Elastase溶液)。(5)取出消化好的肺脏，剪取肺叶，置于无菌细胞培养皿中，用剪刀剪碎肺组织至2 mm3，再用手术刀片切碎。(6)加入5 mL浓度为200 U/mL的DNAseⅠ溶液，37 ℃孵育15 min。(7)加入4 ℃的1×HBSS+液10 mL，以吸管反复吹打组织块，使其尽量分散，然后过75 μm细胞筛，收集细胞悬液，以20 mL 4 ℃的1×HBSS+液洗涤组织块，并用研磨棒轻研组织块，以获得更多细胞。(8)2 500 r/min ，4 ℃离心5 min，弃上清液，拍松细胞。(9)加入1 mL ddH2O，45 s左右加1 mL 2×HBSS+液，再加入4 ℃的1×HBSS+液20 mL。(10)2 500 r/min，4 ℃离心5 min，弃上清液，拍松细胞。加入4 ℃的1×HBSS+液0.5 mL，以台盼蓝液进行细胞计数。调细胞浓度至1×107个/毫升。(11)向细胞悬液中加入下列抗体：CD45-biotin (稀释度1∶200)，CD31-biotin(稀释度2.5-100)，CD34-biotin(稀释度6.5∶100)，Sca-1-AlexaFluor 647(稀释度1∶200)，EpCAM-PE-Cy7(稀释度1∶200)，4 ℃避光孵育45 min。(12)加入5 mL 4 ℃的1×HBSS+液2 mL，混匀，600 g，4 ℃离心5 min，弃上清液，拍松细胞。加4 ℃的1×HBSS+液0.5 mL。(13)向细胞悬液中加入APC eFluor 780-streptavidin 5 μL，4 ℃避光孵育30 min。(14)加入5 mL 4 ℃的1×HBSS+液2 mL，混匀，600 g，4 ℃离心5 min，弃上清液，拍松细胞。加4 ℃的1×HBSS+液1 mL。(15)加入7-AAD 150 μL，15 min后，用流式细胞仪检测并分选BASCSs(CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+细胞)。分选后用流式细胞仪鉴定BASCSs纯度。

1.2.2 小鼠支气管干细胞的三维培养[12,16-17](1)将小鼠肺成纤维细胞系Mlg2908，以DMEM(高糖)培养基+100 mL/L FBS，培养于37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中。(2)BASCSs基础培养基：DMEM/F12培养基，含100 mL/L FBS，10 mL/L ITS液，0.25 mg/mL amphotericin B，100 IU/mL penicillin，100 mg/mL streptomycin和 10 mmol/L SB431542。(3)将Mlg2908细胞和分选得到的BASCSs按1×103∶1×106的比例混匀，与等体积的Matrigel混匀，加入Transwell小室中，注意勿产生气泡。(4)将Transwell小室放入细胞培养板中，将培养板置于37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中5 min，使Matirgel凝固。(5)向培养板下孔中加入BASCSs基础培养基至液面达Matrigel上表面。(6)将上述培养体系置于37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养7 d，隔日换液。(7)第7天在倒置显微镜下拍照，并拼合照片。

2 结果

2.1 BASCs分离结果 通过Elastase酶消化肺组织，每只成年小鼠可得到有核细胞总数(1.6～1.8)×107个，流式细胞技术显示，CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+细胞约占EpCAM+细胞的22 %(见图1)。取部分分选得到的细胞经流式细胞技术再次鉴定，CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+细胞纯度大于90%(见图2)。

2.2 支气管肺泡干细胞培养结果 BASCSs与成纤维细胞混合培养于Matrigel中，第4日，可见小圆形的克隆形成，周围围绕着成纤维细胞(见图3)；继续培养，克隆体积增大，但数量逐渐减少，至第8日，大部分克隆直径可达50 μm，形态各异，克隆与其他区域对比明显(见图4)。

3 讨论

2005年由KIM等[6]首先在小鼠肺支气管肺泡连接区发现了BASCSs。BASCSs 是维持Clara 细胞和肺泡上皮细胞更新的基础。目前认为，BASCSs表达分泌珠蛋白家族成员1A1 (SCGB1A1) 和肺泡表面活性蛋白C(SP-C) ，特异细胞表面标志是干细胞抗原(SCA-1)和上皮细胞黏附分子(EpCAM)，其细胞表型为CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+。

由于肺部结构复杂，且肺上皮细胞更新率较低，使得BASCSs的分离提取、鉴定与体外研究都面临着较大的困难。近年来，随着细胞培养技术的日益进步，已经能够在体外进行BASCSs的三维培养[18]。我们参考国外同行实验方法，在建立了小鼠BASCSs的分离、鉴定和三维培养方法的过程中，获得了一些心得体会。

3.1 关于消化方法的选择 文献中报道可用于分离BASCSs的消化方法主要有以下几种：collagenase dispase 序贯消化[19]，dispase、collagenase/dispase混合酶序贯消化[20]和Elastase分次注入消化[11]。我们比较了这三种消化方法，结果以Elastase分次注入消化获得的有核细胞数量最多，所以选用该消化法。

3.2 细胞分离技巧 BASCSs处于终末细支气管和肺泡的交界处，而且数量较少，用常规的酶消化法难以制备。其分离的关键在于让酶能够充分作用于终末细支气管和肺泡的交界处。所以我们采用了分次肺脏酶灌注法。其操作的要点是：(1) 获得完整肺脏，如果肺脏被膜有破损，酶液漏出，会导致分离到的BASCSs数量大大下降。为此，解剖肺脏时务必十分小心，特别注意不要让肋骨残端刺破肺脏被膜；(2)要尽量切碎组织，组织块越小越好，这样才能使更多的BASCSs分散到分离液中，但不能在细胞筛上研碎组织，吹打组织悬液时也要温和操作，否则细胞容易破碎；(3)所有操作尽量在冰上进行，尽可能缩短操作时间，以保证尽可能多的细胞存活。

3.3 关于红细胞的去除 细胞分离的过程中，不可避免地会混入红细胞。过多的红细胞混入会影响CD31、CD34、CD45抗体染色结果。所以，在染色前需要去除红细胞。文献中最常见的去除红细胞的办法是用红细胞裂解液[21]。另一种方法是利用红细胞对低渗液的敏感度高于有核细胞的特点，用双蒸水短暂处理细胞悬液，然后加入等体积的两倍浓度的培养基恢复渗透压。通过比较BASCSs的三维培养结果，两种方法差别不大，第二种方法操作更便捷，而且可以避免红细胞裂解液中的一些成分对BASCSs产生影响的可能。所以在实验中采用了第二种方法。

3.4 细胞三维培养技巧 BASCSs在三维培养中会逐步分化，形成克隆。培养的时间可达15 d，但最佳观察时间在7 d左右。细胞培养操作要点如下： (1)三维培养的时间较长，一定要注意预防污染，特别是真菌污染，必要时可以添加真菌抑制剂；(2)在三维培养体系中，肺成纤维细胞生长速度远远高于BASCSs，所以一定要加入成纤维细胞抑制剂SB431542；(3)将细胞与Matrigel混合的操作务必在冰上，否则Matrigel容易凝固，堵塞吸头；(4)为使Matrigel上表面附近的克隆能够正常生长，可以向Matrigel表面滴1滴培养基。培养板下孔中的培养基液面可以略高于Matrigel上表面。

通过对相关文献的比较与实验，我们探索出一套适合小鼠BASCSs的分离、鉴定与三维培养的实验体系。最佳分离方法，即用Elastase分次注入消化，此法获得的有核细胞数量最多。分离要点为：肺脏须完整，不要让肋骨残端刺破肺脏被膜；尽量切碎组织，吹打组织悬液时也要温和操作；所有操作尽量在冰上进行，尽可能缩短操作时间；用双蒸水短暂处理细胞悬液，然后加入等体积的两倍浓度的培养基恢复渗透压，以去除多余的红细胞。鉴定方法：用流式细胞仪检测并分选，分选后用流式细胞仪鉴定BASCSs纯度。三维培养时，要注意预防污染，特别是真菌污染；要加入成纤维细胞抑制剂SB431542；务必在冰上将细胞与Matrigel混合；可使培养基浸润于Matrigel表面，以使其附近的克隆能够正常生长。该方法简单高效，能够为进一步研究BASCSs的相关特性奠定实验基础。