表面活性蛋白A单核苷酸基因多态性与过敏性鼻炎皮下特异性免疫治疗疗效相关性分析①

何 勇 徐博怀 汤继元 余璐洁 张 彬

(宁波大学医学院附属医院,宁波 315020)

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)也称过敏性鼻炎，是特应性个体接触过敏原后，由IgE介导的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病。遗传和环境因素在AR的发生过程中共同发挥重要作用，DNA序列的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与AR的易感性存在关联[1]。在AR的治疗方法中变应原特异性免疫治疗是《2015版过敏性鼻炎诊断与治疗天津指南》推荐的一线治疗方案，其中皮下特异性免疫治疗(subcutaneous immunotherapy，SCIT)可以通过免疫调节机制改变AR自然进程[2]。而不同个体接受SCIT治疗的效果有差异，很可能与宿主遗传背景的SNPs相关。研究表明,表面活性蛋白A(surfactant protein A， SP-A)及其SNPs与过敏性哮喘严重程度有关[3]，并且影响个体对变应性疾病的易感性[4,5]，但SP-A基因多态性是否影响AR免疫治疗效果并不十分清楚，本研究通过前瞻性研究的方法，对接受皮下免疫治疗的AR患者进一步探讨SP-A基因的多态性与SCIT治疗效果的关联，以期加深对SCIT治疗机制的了解，并且可以根据个体对免疫治疗的敏感度，制定个体化治疗方式，从而提高治疗效果。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 选取2015年8月至2018年1月间就诊于宁波大学医学院附属医院的AR患者160例，采用丹麦ALK公司的“安刺”标准化皮肤点刺试剂，屋尘螨和/或粉尘螨过敏++以上判定为阳性，愿意接受SCIT治疗。

1.1.2纳入标准 年龄5～55岁(性别不限)；符合2015年过敏性鼻炎指南中重度过敏性鼻炎诊断标准[2]，可合并轻、中度过敏性哮喘患者；血清sIgE检测或皮肤点刺试验提示变应原以尘螨阳性为主；愿意接受SCIT治疗AR；以上标准中若有任一项属于“否”的患者不能入选。

1.1.3排除标准 伴有严重的或未控制的哮喘以及不能逆转的呼吸道阻塞疾病；正在使用β受体阻滞剂，或血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)进行治疗；严重心血管、代谢、免疫、神经、血液、消化系统疾病；患者无法理解治疗的风险性和局限性；目前正在参加其他研究或30 d内参加过其他临床研究者，或直接参与此研究的工作人员；具有精神病史、对抗性格、不良动机、多疑或其他情感与智力障碍，可能影响研究的知情有效性。本研究经宁波大学医学院附属医院伦理委员会备案通过，所有纳入对象本人或其监护人均已签署研究知情同意书。

1.2方法

1.2.1治疗方案 采用丹麦ALK公司的“安脱达SQ”标准化屋尘螨变应原制剂，采用皮下注射方法，起始盒规格4 ml×5 ml，浓度分别为102SQ/ml、103SQ/ml、104SQ/ml和105SQ/ml，起始疗程21周，然后使用维持盒，1 ml×5 ml，105SQ/ml，每4～6周注射1次。

免疫治疗早期同时配合药物使用，后期在鼻部症状控制不佳或不能忍受的情况下，允许使用对症药物进行控制，用药方法参考AR诊断和治疗指南[2]。

1.2.2观察指标与疗效评定 患者开始SCIT治疗前、治疗后5个月、治疗后1年分别进行临床症状评分，使用视觉模拟量表(visual analog scale，VAS)对AR常见症状及和AR有关的变应性结膜炎症状进行评价。鼻腔症状疗效评定(VAS)：患者在0～10 cm 标尺上划线标出各种症状相应的分值，按“0～10分”进行评价，“0”代表没有此症状，“10”代表此种症状最重。疗效评定根据2004 年兰州的变应性鼻炎的诊治原则和推荐方案[6]:疗效评分(%)=(治疗前VAS评分-治疗后6个月VAS评分)/治疗前VAS评分×100%，划为两个标准，好转：>25%，未好转：≤25%。

1.2.3实验材料、试剂 血液基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，分子核酸染料、正反向引物购自上海生工生物科技有限公司，Marker、Loading buffer购自TaKaRa公司，Agarose购自赛默飞，PCR试剂盒购自上海生工/TaKaRa公司，离心机购自德国Eppdendorf公司，涡旋振荡器购自上海汗诺仪器，电泳仪购自北京六一公司，凝胶成像仪购自上海天能公司，Nano-drop购自杭州奥盛仪器有限公司，测序仪购自ABI。

1.2.4DNA扩增、多态性位点的检测与基因分型 白细胞分离：每位研究对象均用真空EDTA抗凝管采集静脉血5 ml，按标准离心方法在4 h内离心，分离出的血浆(含白细胞层)保存于1.5 ml Eppendorf管(每个样本保存2份)，-20℃冷冻保存备用。SNPs分型：根据文献报道选择SFTPA1和SFTPA2的编码区中造成错义突变的SNPs进行研究[5]，根据hapmap数据库(http://www.hapmap.org)提供的SNP序列信息，制备Taqman-MGB探针，进行基因分型，SNPs位点有rs1059047、rs1136450、rs1136451、rs1059057、rs4253527、rs1059046、rs17886 395、rs1965407、rs1965708。

1.3统计学分析 应用EpiData 3.10、SPSS20.0、STATA11.0对数据进行管理和分析，分析方法包括实验结果重复性的Kappa检验，计数资料的单因素χ2检验(包括基因型在对照人群中的Hardy-Weinberg平衡检验)，计量资料的t检验，单因素和多因素方差分析，单因素和多因素回归分析、单倍型分析、两因素和三因素交互作用的相加或相乘模型分析等。

2 结果

2.1患者一般临床特征与SCIT有效率的关系 160例AR患者有119例完成1年随访，41例患者因各种原因放弃SCIT或者拒绝随访。81例患者好转，38例患者未好转，好转率68%。非条件Logistic回归分析结果显示患者性别、年龄、是否合并哮喘、病程、加重季节、超过4周、治疗史、手术史、顺产、家族史、家中环境，屋尘螨及粉尘螨皮肤指数与免疫治疗有效率无显著相关性。结果如表1。

表1 患者一般临床特征与治疗有效率的关系

Tab.1 Relationship of clinical manifestation and effective rate of SCIT

Note：AR is the abbreviation of allergic rhinitis；AS is the abbreviation of allergic asthma.

表2 两组患者SNP位点分布的差异

Tab.2 Difference of SNP loci distribution between two groups of patients

SNPClassificationGroupingImprovedUnimprovedOR95%CIPSP-A1 -50C>G (rs1136450)CC54(66.67)21(55.26)11CG25(30.86)12(31.58)0.8100.324-1.9020.629GG2(2.47)5(13.16)0.1560.028-0.8650.0341)-133A>G(rs1059057)AA7(8.64)3(7.89)11AG71(87.65)34(89.47)0.8950.218-3.6760.878GG3(3.70)1(2.63)1.2860.092-17.9510.852-219C>T(rs4253527)CC7(8.64)2(5.26)11CT72(88.89)34(89.47)0.6050.119-3.0690.545TT2(2.47)2(5.26)0.2860.023-3.5250.329SP-A2-9A>C(rs1059046)AA5(6.17)1(2.63)11AC76(93.83)37(97.37)0.4110.046-3.6440.424CC0(0.00)0(0.00)----91C>G(rs1059047)CC45(55.56)20(52.63)11CG25(30.86)11(28.95)1.0100.418-2.4430.982GG11(13.58)7(18.42)0.6980.236-2.0650.516-223A>C(rs1965708)AA12(14.81)11(28.95)11-AC58(71.60)20(52.63)2.6581.105-6.9640.046aCC11(13.58)7(18.42)1.4410.412-5.0380.568

Note：1)P≤0.05.

2.2SNPs与免疫治疗有效率的关系 119例患者各位点均扩增成功，统计分析使用SAS9.4版本进行分析。-19C>T位点三种基因型分布为CC (37例，频率 31.09%)、CT(80例，频率 67.23%)和TT(2例，1.68%)。-50C>G位点三种基因型分布为CC (75例，频率63.03%)、CG(37例，频率 31.09%)和GG(7例，5.88%)。-62A>G位点三种基因型分布为AA(28例，频率 23.53%)、AG(90例，频率 75.63%)和GG(1例，0.84%)。-133A>G位点三种基因型分布为AA (10例，频率 8.4%)、AG(105例，频率 88.24%)和GG(4例，3.36%)。-219C>T位点三种基因型分布为CC (9例，频率 7.56%)、CT(106例，频率 89.08%)和TT(4例，3.36%)。-9A>C位点三种基因型分布为AA (6例，频率 5.04%)、AC(113例，频率 94.96%)和CC(0例，0%)。-91C>G位点三种基因型分布为CC (65例，频率 54.62%)、CG(36例，频率 30.25%)和GG(118例，15.13%)。-140C>T位点三种基因型分布为CC (1例，频率 0.84%)、CT(106例，频率 89.08%)和TT(12例，10.08%)。-223A>C位点三种基因型分布为AA (23例，频率 19.33%)、AC(78例，频率 65.55%)和CC(18例，15.13%)。

非条件Logistic回归分析结果显示：-50C>G位点CC基因型患者免疫治疗有效率明显高于GG基因型患者(P=0.034；OR=0.156)；-223A>C位点AC基因型患者免疫治疗有效率显著高于AA型患者(P=0.046,OR=2.658)。-133A>G位点、-219C>T位点、9A>C位点、-91C>G位点基因型与免疫治疗有效率无显著相关性。具体见表2。-19C>T(rs1059047)，-62A>G(rs1136451)，-140C>T(rs1965407)位点信息不平衡，无法给出合理的统计学数据。

2.3SNPs与屋尘螨、粉尘螨皮肤点刺强度的关系 由表3可见-62A>G GG基因型与-140C>T CC基因型只有1例，故没有纳入统计分析。使用非参数分析对SP-A基因不同基因型屋尘螨、粉尘螨皮肤指数比较，发现-50C>G位点CC基因型和GG基因型患者屋尘螨皮肤指数大于CG基因型患者， 差异具有统计学意义(P≤0.05)；-140C>T位点TT基因型患者屋尘螨皮肤指数大于CG基因型患者，差异具有统计学意义(P≤0.05)；-62A>G位点AG基因型患者粉尘螨皮肤指数大于AA基因型患者，差异具有统计学意义(P≤0.05)。

表3 SP-A基因不同基因型屋尘螨、粉尘螨皮肤指数的比较

Tab.3 Comparison of skin index of dermatophagoides pteronyssinus(Der p)and dermatophagoides farinae(Der f)with gene types of SP-A gene

SNPGenotypesnSkin Index of Der pPSkin Index of Der fPSP-A1-19C>T (rs1059047)CC37(31.1)3.22±0.1110.7872.97±0.1370.669CT80(67.2)3.26±0.0792.98±0.104TT2(1.7)3.50±0.5003.50±0.500-50C>G (rs1136450)CC75(63.0)3.35±0.0820.0252)3.07±0.960.153CG37(31.1)3.03±0.1062.76±0.166GG7(5.9)3.43±0.2023.29±0.286-62A>G1)(rs1136451)AA28(23.5)3.14±0.1760.7062.68±0.1630.0172)AG90(75.6)3.29±0.0643.07±0.093-133A>G (rs1059057)AA10(8.4)3.20±0.1330.8493.00±0.2110.683AG105(88.2)3.26±0.0692.99±0.090GG4(3.4)3.25±0.4792.75±0.250-219C>T (rs4253527)CC9(7.6)2.89±0.3090.3252.56±0.1760.063CT106(89.1)3.28±0.0653.00±0.089TT4(3.4)3.25±0.2503.50±0.289SP-A2-9A>C (rs1059046)AA6(5.0)3.50±0.3420.2723.00±0.3650.916AC113(95.0)3.24±0.0642.98±0.084-91C>G (rs17886395)CC65(54.6)3.18±0.0790.0772.92±0.1060.517CG36(30.3)3.47±0.0933.06±0.164GG18(15.1)3.06±0.2353.06±0.206-140C>T1)(rs1965707)CT106(89.1)3.19±0.670.0042)2.93±0.8800.063TT12(10.1)3.75±0.1313.42±0.193-223A>C(rs1965708)AA23(19.3)3.39±0.1220.5903.00±0.1660.069AC78(65.5)3.21±0.0823.09±0.095CC18(15.1)3.28±0.1582.50±0.259

Note：1)Because -62A>G GG and -140C>T CC only have one case separately,they are not included in statistics，2)P≤0.05.

3 讨论

特异性免疫治疗是一种针对过敏性疾病病因的治疗方式，是唯一可能改变AR自然进程的治疗方式。2010版的ARIA(Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma)指南从循证医学的角度，对季节性和持续性AR(伴或不伴哮喘)进行特异性免疫治疗的评价均为“推荐”[7]，也是我国指南推荐的一线治疗方案[2]。常见的特异性免疫治疗方式有SCIT和舌下特异性免疫治疗，本研究均使用SCIT治疗AR。目前已知SCIT治疗后可以恢复受损的天然免疫功能，调节体内Th1/Th2免疫平衡[8]。

目前普遍认为AR受多种因素的作用，是一种由遗传因素和环境因素共同导致的多基因、免疫性疾病，SNPs是常见的影响个体对疾病易感性的遗传因素。目前已发现AR易感性与药物治疗的有效性与多种基因的SNPs有关[9]，但尚无报道发现与AR免疫治疗疗效相关的SNPs。已有证据表明SP-A及其SNPs在呼吸道变应性疾病中也起着重要作用。SP-A是在肺泡表面表达最丰富的蛋白质，其主要生物学功能是维持磷脂单分子结构稳定，以降低肺泡表面张力[10]。SP-A在先天免疫反应过程中起着重要作用，如细菌清除、宿主防御及抑制炎症等等。人类SP-A基因定位于10号染色体的q21～q24上，包括两个高度同源的功能基因SFTPA1和SFTPA2，分别编码SP-A的两个同源亚基SP-A1和SP-A2。目前已鉴定的人类SFTPA1的编码区存在5个SNP位点，即19、50、62、133和219，SFTPA2的编码区存在4个SNP位点，即9、91、140和233[11-13]。SP-A也被检测到在人鼻黏膜上有表达[14]。人SP-A还可以与尘螨提取物及纯化的尘螨变应原结合，通过空间位阻或竞争性抑制的方式抑制变应原特异性IgE与尘螨提取物结合，抑制特异性IgE和嗜碱性粒细胞中组胺的释放[15]。研究报道发现肺泡表面SP-A浓度预示着过敏性哮喘的严重程度[3]，还发现SP-A的 SNPs与汉族人过敏性鼻炎易感性有关[5]。以上证据都表明，SP-A蛋白及SP-A的SNPs影响个体对变应性疾病的易感性，而SP-A的SNPs对SCIT的治疗效果是否也有影响还不清楚。

本研究将接受SCIT治疗的患者根据疗效分为好转组和未好转组两组，比较两组之间SFTPA1和SFTPA2编码区各位点SNPs差异，发现SFTPA1编码区-50C>G位点CC基因型患者免疫治疗有效率明显高于GG基因型患者；SFTPA2编码区-223A >C位点AC基因型患者免疫治疗有效率显著高于AA型患者。其余位点基因型与免疫治疗有效率无显著相关性。已有证据表明SP-A2蛋白在固有免疫中的作用要明显大于SP-A1蛋白[16]，并且发现SFTPA2编码区-223A>C位点的突变与AR易感性有关[16,17]。本研究进一步发现该SNP与AR免疫治疗疗效有关。-223A>C位点编码的氨基酸是糖类识别结构域蛋白的一部分，该蛋白功能是结合吸入性过敏物质[18]，我们猜想该位点突变可能影响糖类识别结构域蛋白功能，而影响过敏性疾病易感性和免疫治疗疗效。与既往研究不同的是，以往研究不认为SFTPA1编码区与AR易感性之间有关联[5]，本研究发现2个与过敏性鼻炎SCIT疗效有关的SNPs，分别来自于SFTPA1和SFTPA2编码区，说明SP-A2，SP-A1可能均与过敏性鼻炎SCIT疗效有关。

本研究结果发现-50C>G位点、-140C>T位点、-62A>G位点不同基因型间屋尘螨、粉尘满皮肤指数不同。其中-50C>G位点既提示与过敏性鼻炎SCIT免疫治疗疗效有关又提示与皮肤屋尘螨点刺强度有关，两者之间是否存在因果关联尚需进一步研究。既往同类研究并未发现这两者之间的相关性，这可能与所使用的皮肤点刺液试剂不同有关[5]。已有研究结果指出血清特异性IgE水平和外周血嗜酸细胞计数不能正确反映AR患者的临床症状和生活质量状况[19]，因此本研究并未对SNPs与IgE水平和外周血嗜酸细胞计数进行相关分析。

综上，本研究结果发现SP-A1与SP-A2基因的SNPs可能影响AR免疫治疗有效率，这个结果有利于加深对SCIT治疗机制的了解，可提供在基因水平上对疾病进行分型的可能，为预测AR的SCIT疗效提供理论依据，并且可以从基因角度根据个体对治疗的敏感度，制定个体化治疗方式，从而提高治疗效果。

本研究并未发现性别、年龄、是否合并哮喘、病程、加重季节、超过4周、治疗史、手术史、顺产、家族史、家中环境，屋螨指数及粉螨指数与SCIT疗效的相关性。考虑到样本量小，尚无法得出准确结论。本研究团队将继续增大样本量延长随访时间，以期得到更加准确的结论。