STK17A基因经TGF-β/SMAD信号通路调控宫颈癌细胞增殖凋亡及侵袭的机制研究

刘海霞 宋 梅 戴淑凤

(青岛市第三人民医院,青岛 266041)

宫颈癌是当前世界范围内女性发病率第二的肿瘤，持续感染高危型人类乳头瘤病毒是引起该病的主要原因[1,2]。巴氏涂片以及液基薄层细胞学检查(thinprep cytology test,TCT)是近年来宫颈癌筛查的一种低成本且操作简便的筛查手段[3]。尽管宫颈癌诊断和治疗手段不断改进，但是晚期宫颈癌患者的5年生存率仍然很低，因此，对宫颈癌进展的潜在分子机制进行研究并且提供有效的治疗方法十分重要。丝氨酸/苏氨酸激酶17A (serine/threonine kinase 17A,STK17A)是死亡相关蛋白家族(death-associatedprotein，DAP)中的一员且DAP家族中成员被证实在多种癌症中的表达受到限制，同时与多个细胞凋亡和自噬相关通路有关[4-6]。近年来关于STK17A在胶质母瘤、大肠癌、睾丸癌等癌症进展中的研究也被逐渐发现[7-9]。但是关于其在宫颈癌中的作用尚不明确。转化生长因子β (transforming growth factor beta,TGF-β)/SMAD通路是癌变过程中的重要调节通路，研究证实其在宫颈鳞癌中被激活[10]。在前人研究基础上，本研究旨在明确STK17A在宫颈癌中的价值并探讨其具体作用途径。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1材料与试剂 pcDNA3.1(+)质粒购自Invitrogen；基因组DNA提取试剂盒、Lipofectamine 3000试剂盒、总RNA提取试剂盒、TransScriptⅡGreen One-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒、CCK-8试剂盒购自赛默飞世尔；人子宫颈上皮细胞及Hela、SiHa和C-33A宫颈鳞癌细胞系购自拜力生物；TGF-β/SMAD通路抑制剂SB-431542购自美国Selleck；苏木素染液、伊红染液、DAB染液购自北京索莱宝；Western blot中所有抗体购自ABCAM；RIPA细胞裂解液；Matrigel胶、Transwell小室购自上海复申生物科技有限公司；Anexin-V-FITC染液、PI染液购自锐赛生物；BD FACSCALIBUR 流式细胞仪德国贝克曼；倒置显微镜购自奥林巴斯；X960全自动PCR仪购自力康生物医疗科技有限公司；SorvallTMLegendTM台式离心机购自赛默飞世尔。STK17A序列及shRNA序列交由华大基因合成。

1.1.2组织来源 收集我院2012年至2017年43例宫颈癌患者宫颈癌组织及癌旁组织。患者年龄23～67岁，平均年龄42.2岁。鳞状细胞癌32例，腺癌11例。根据FIGO分期，癌组织中Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ 5例。所有患者均在知情同意书上签字并且组织实验均通过我院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1STK17A沉默及过表达重组质粒构建 利用NCBI上人的STK17A mRNA全长(NM_004760.3)在BLOCK-iTTMRNAi Designer网站在线设计STK17A的shRNA序列(5′-CACCGGGTGACATTAAGATTGTTGACGAATCAACAATCTTAATGTC-ACCC-3′)。参照GenBank中的STK17A基因序列，采用Primer 5.0设计一对特异引物(5′-TCTGAGTCGGCTGTTGATTTC-3′，3′-GGGGTGCTTTAGACATTCTTCA-5′)并分别在上下游引物加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。pcDNA3.1(+)质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后与目的基因片段连接，随后转化至DH 5α大肠杆菌进行克隆。经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用DNA大量抽提试剂盒提取大肠杆菌中重组载体，保存至-80℃备用。

1.2.2细胞分组及转染 人子宫颈上皮细胞培养于完全培养基中。Hela、SiHa、C-33A宫颈鳞癌细胞系培养于含10%FBS及1%P/S的MEM培养基中。待细胞达到80%汇合度时按1∶2～1∶6进行传代和培养。

Western blot筛选STK17A蛋白表达最低的细胞系用于后续实验并分组：阴性对照组(转染含有无关序列的重组质粒)、基因沉默组(转染含有STK17A shRNA的重组质粒)、基因过表达组(转染含有STK17A 片段的重组质粒)、通路抑制剂组(TGF-β/SMAD通路特异性抑制剂处理宫颈癌细胞)、联合组(TGF-β/SMAD通路抑制联合STK17A过表达处理细胞)。转染方式：传代后取对数期细胞用于转染。调整细胞密度后分别将50 μl Opti-MEM与1.5 μl Lipofectamine 3000以及1 μg DNA(浓度为2 μg/μl)相混合作为A液和B液，之后将A液和B液按照1∶1比例混匀并置于室温下孵育。随后添加DNA-脂质体复合物，培养24～48 h后更换培养基。抑制剂处理方法：SB-431542溶于适量DMSO中，终浓度为100 μmol/L。血清饥饿处理细胞24 h后加入SB-431542，处理48 h。

1.2.3HE染色 将癌组织及癌旁组织进行石蜡包埋后切片。温箱烤干1 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，蒸馏水冲洗，苏木素浸染切片8～10 min，水洗1～2 min，1%盐酸分化30 s，流水洗涤至天蓝色。依红染液浸染切片2～3 min，水洗1～2 min。梯度酒精脱水2次，脱水后的切片移入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ分别透明3～5 min和5～10 min，中性树胶固封。

1.2.4免疫组化检测 将癌组织及癌旁组织进行石蜡包埋后切片。温箱烤干1 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。随后经双氧水及蒸馏水洗涤，每次1 min。 0.01 mol/L枸缘酸缓冲液进行微波抗原修复。5% BSA室温封闭20 min，滴加一抗和二抗，分别于37℃条件下孵育，PBS冲洗。滴加适量SABC，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染2 min，自来水冲洗。梯度乙醇脱水后，中性树胶固封。对组织染色强度(SI)及阳性细胞率(PP)进行评分。SI分为4级：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。PP分为5级：0分为无阳性细胞<5%，1分为阳性细胞5%～25%，2级为25%～50%，3级为51%～75%，4级为>75%。综合评分为SI与PP乘积，0为阴性，1为弱阳性(+)，2记为中阳性(++)，大于3记为强阳性(+++)[11]。借助Image J软件对免疫组化结果进行半定量分析，计算癌组织和癌旁组织中STK17A的阳性表达率。

1.2.5qRT-PCR 按Trizol试剂说明书提取宫颈癌细胞系中总RNA。DEPC处理的超纯水溶解RNA，使用ND-1000测量260 nm和280 nm下吸光值，鉴定RNA的质量和浓度。利用TransScriptⅡGreen One-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒一步完成RT-PCR合成及Q-PCR。反应体系和反应条件均依据试剂盒说明书进行。使用实时荧光定量PCR仪进行扩增，相对表达水平以GAPDH为内参，引物序列由华大基因合成见表1。采用溶解曲线评价PCR结果的可靠性，取CT值 (扩增动力曲线拐点)，ΔCt=CT (目的基因)-CT (GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt (模型组)-ΔCt(正常组)。

1.2.6Western blot 弃去各组细胞培养液，PBS冲洗，加入200 μl含PMSF的RIPA裂解液。匀浆、裂解后离心。去离子水调整蛋白浓度，随后行SDS-PAGE凝胶电泳并转至PVDF膜上。含5% BSA的TBST在摇床上室温封闭1 h。加入一抗兔抗大鼠STK17A、p-SMAD3、N-cadherin、E-cadherin和TIMP-3多克隆抗体，以GAPDH作为内参。转印面朝上，置于4℃冰箱振荡过夜。次日，用TBST漂洗。同法加入稀释好的山羊抗兔IgG作为二抗，4℃孵育4～6 h，TBST洗膜。取化学发光试剂A液与B液按1∶1混匀后，均匀滴加在PVDF膜上，显影液显影。所有蛋白免疫印迹的条带进行相对光密度分析，以目标条带与内参照条带的灰度值之比作为蛋白质的相对表达量。

1.2.7CCK-8测定细胞活力 测定各组宫颈癌细胞浓度，加一定量细胞悬液至96孔板中并调整至细胞浓度为105孔-1并设置对照。于37℃，5%CO2下培养过夜。随后每孔加入10 μl CCK-8溶液。随后测定0 h、24 h、48 h下的吸光值(450 nm)。

1.2.8细胞划痕实验 各组细胞用96孔板接种前先用marker笔在12孔板背面画横线标记。0.25%胰酶消化细胞2 min后接入96孔板。细胞铺满板底后，1 ml枪头垂直于孔板进行划痕，尽量保证各划痕宽度一致。吸去细胞培养液，PBS洗涤3次，每次5 min。随后加入无血清MEM培养基，拍照记录。将96孔板放入培养箱培养，48 h后取出拍照。细胞迁移率=(0 h两端细胞距离-48 h两端细胞距离)/0 h两端细胞距离×100%。

1.2.9Transwell细胞侵袭实验 按1∶10用预冷无血清的MEM培养基稀释Matrigel胶，吸取充分混匀的Matrigel，每上室加入100 μl稀释后的Matrigel，室温放置2 h；使用前加入200 μl 无血清1640培养基冲洗，将上述各组转染24 h后的宫颈癌细胞用无血清DMEM培养基重悬，计数并稀释至3×105个/ml，取100 μl 加入Transwell上室中，同时往下室中加入600 μl 10%血清的DMEM培养基，按照Transwell小室说明书操作，用结晶紫染色，光镜下随机选取三个视野并计数跨膜的细胞数，计算细胞侵袭率。侵袭率=穿过基质胶的细胞数/总细胞数×100%。

表1 qRT-PCR引物

Tab.1 qRT-PCR primer

GeneUpstream primer(5′-3′)Downstream primer(5′-3′)TGF-β1CTGCAAGACTATCGACATGGAATGGTGGAAACCCACAACGSMAD3AAACCAGGCTGGCTAAACAAGTGGCAACAGCAGCAGTGAAGGTGE-cadherinCATAAACGAGGTTCTGTCTTCAGGATAATAGTCGGGAGGTGN-cadherinAAGACAATGACTACGTGTAGGATAGCCGGACTAGGGATGCTIMP3CATGTGCAGTACATCCATACGGCATCATAGACGCGACCTGTCAGAPDHTACATGGCTGGGGTGTTGAAAAGAGAGGCATCCTCACCCT

1.2.10Annexin V-FITC/PI双染检测宫颈癌细胞凋亡 处理48 h后各组宫颈癌细胞经PBS洗涤细胞1次，随后在2 000 g下离心5 min，弃上清，重悬细胞并调整其密度为4×105个/ml。加入500 μl结合缓冲液悬浮细胞，之后加入5 μl Anexin-V-FITC轻柔混匀后随即加入5 μl PI染液混合均匀，冰育避光反应10～12 min。流式细胞仪在5 min内上机检测，激发波长为488 nm，530 nm下检测FITC和575 nm下检测PI。

2 结果

2.1宫颈癌和癌旁组织病理情况观察 HE染色结果显示(图1)：宫颈鳞癌呈巢团状，细胞核深染大小不一，可见病理性核分裂像，核膜增厚，染色质丰富偶见核沟。组织排列紊乱，无极性。巢团中间可见角化，角化珠形成趋势，间质减少仅见少许纤维组织及血管组织。而癌旁组织中细胞间隔明显，且与黏膜下组织存在较为显著的界限。

2.2宫颈癌和癌旁组织中STK17A阳性表达情况 免疫组化对癌症及癌旁组织中STK17A进行定位与半定量。结果发现(图2)：STK17A蛋白在胞浆和核内表达不均一。与癌旁组织相比阳性率为(72.88±9.21)%，癌症组织中STK17A细胞阳性率为(3.12±1.18)%，其表达显著下调(P<0.05)。

2.3STK17A蛋白在宫颈癌细胞系中的表达 Western blot检测不同宫颈癌细胞株中STK17A表达情况(图3)。与HCECs相比，其余宫颈癌细胞株中STK17A表达显著下调(均P<0.05)。此外，Hela细胞系STK17A最低，因此选择Hela细胞系进行后续实验。

2.4各组Hela细胞中STK17A、TGF-β1、SMAD3、E-cadherin、N-cadherin和TIMP3表达 研究结果显示(图4)：Hela细胞经STK17A沉默或过表达处理后均有显著效果(均P<0.05)。与阴性对照组相比，TGF-β1、SMAD3、N-cadherin mRNA及蛋白在基因沉默组中显著上调，但E-cadherin和TIMP3表达在基因沉默组中被显著抑制(均P<0.05)。相反，Hela细胞经STK17A过表达或抑制TGF-β/SMAD3通路后TGF-β1、SMAD3、N-cadherin 表达下调，但E-cadherin和TIMP3表达被显著诱导(均P<0.05)。

图2 宫颈癌及癌旁组织免疫组化染色结果Fig.2 Immunohistochemical staining results of cervical cancer tissue and adjacent tissue

图3 不同细胞系中STK17A蛋白表达情况Fig.3 STK17A protein expression in different cell linesNote: A.Protein bands of STK17A in different cell lines;B.Quatification of STK17A protein in different cell lines.Compared with HCECs,*.P P

图4 各组细胞中STK17A、TGF-β1、SMAD3、E-cadherin、N-cadherin和TIMP3 mRNA和蛋白表达情况Fig.4 mRNA and protein expression of STK17A,TGF-β1,SMAD3,E-cadherin,N-cadherin and TIMP3 in each groupNote: A.mRNA expression of STK17A,TGF-β1,SMAD3,E-cadherin,N-cadherin and TIMP3 in each group;B.Protein bands of STK17A,TGF-β1,p-SMAD3,E-cadherin,N-cadherin and TIMP3 in each group;C.Quatification of STK17A,TGF-β1,p-SMAD3,E-cadherin,N-cadherin and TIMP3 protein expression in each group.Compared with NC group,*.P P

2.5各组细胞活力检测结果 CCK-8检测各组细胞中黄色甲臜含量(生成的甲臜物数量与活细胞数量成正比)。结果显示(图5)：与阴性对照组24 h和48 h相比，STK17A shRNA转染Hela细胞后能显著增加其细胞活力(P<0.05)。相反，STK17A过表达或抑制TGF-β/SMAD3通路后Hela细胞活力被显著抑制(均P<0.05)。同时，联合组对Hela细胞抑制效果更加明显(P<0.05)。

2.6各组细胞迁移和侵袭能力检测结果 细胞划痕和Transwell侵袭实验评定各组细胞的侵袭转移能力。结果显示(图6)：与阴性对照组相比，STK17A 沉默处理后Hela细胞侵袭转移能力被显著诱导(P<0.05)。相反，STK17A过表达或抑制TGF-β/SMAD3信号通路后Hela细胞株移行及跨Matrigel胶能力被明显抑制(均P<0.05)。上述两者联合处理能更显著地抑制Hela细胞侵袭转移能力(P<0.05)。

图5 各组细胞活力检测结果Fig.5 Cell viability results in each groupNote: Compared with NC group,*.P P

图6 各组细胞侵袭转移能力检测结果

Fig.6 Invasion and metastasis ability in each group

Note: A.Scratch healing results in each group at 0 h and 48 h;B.Crystal violet staining results in each group;C.Quatification of migration rate in each group;D.Quatification of invasion rate in each group.Compared with NC group,*.PP

图7 各组细胞凋亡情况Fig.7 Cell apoptosis in each groupNote: A.Image output by flow cytometer;B.Quatification of cell apoptosis in each group.Compared with NC group,*.P P

2.7各组细胞凋亡情况检测结果 Annexin V-FITC/PI双染检测各组细胞中早期与晚期凋亡细胞的比例。结果显示(图7)：与阴性对照组相比，STK17A 沉默处理后凋亡的Hela细胞凋亡明显减少(P<0.05)。相反，STK17A过表达或抑制TGF-β/SMAD3信号通路能显著诱导Hela细胞的凋亡(均P<0.05)。上述两者联合处理能更显著地诱导Hela细胞的凋亡(P<0.05)。

3 讨论

宫颈癌作为最常见的妇科肿瘤之一，当前其分子机制仍然缺乏足够认识。STK17A(DRAK1) 经研究证实在凋亡调节中起重要作用，与肿瘤的进展密切相关[12，13]。在本研究中，我们重点探究了STK17A介导TGF-β/SMAD 信号通路对宫颈癌进展的调控作用，结果证实，STK17A过表达能够抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭同时诱导其凋亡，在宫颈癌中起保护作用。

首先我们在研究中发现，STK17A在宫颈癌组织中表达显著降低。STK17A主要位于细胞核内，通过蛋白激酶C的磷酸化转移到细胞核外，有证据表明，STK17A与肿瘤抑制因子p53密切相关[12]。Short等[8]则发现STK17A基因在大肠癌中起保护作用，敲除该基因的表达能够促进大肠癌的上皮间质转化。也有证据表明，STK17A敲除会引起睾丸癌细胞对顺铂敏感性的降低[9]。此外，也有研究发现STK17A过表达能够促进前列腺癌细胞的凋亡[14]。本研究进一步发现STK17A在宫颈癌中表达显著降低，过表达STK17A能够抑制宫颈癌的进展，且这一作用主要是通过TGF-β/SMAD信号通路实现的。TGF-β/SMAD通路是宫颈癌疾病发病过程中的重要通路之一，先前有研究证实，宫颈鳞癌患者癌组织中TGF-β1以及SMAD4表达升高，TGF-β/SMAD通路被激活[10]。本研究中qRT-PCR以及Western blot实验检测结果显示，相对于阴性对照组，STK17A基因沉默组中TGF-β1、SMAD3表达升高，表明TGF-β/SMAD信号通路被激活。而过表达STK17A后，TGF-β/SMAD通路相关因子的表达被显著抑制。此外，进一步过表达Hela细胞中STK17A或抑制TGF-β/SMAD信号通路后发现E-cadherin以及TIMP3的表达显著升高，TGF-β1、SMAD3以及N-cadherin表达下调。经典钙黏素家族的N-cadherin和E-cadherin被认为是上皮间质转化的重要标记物，宫颈癌在内多种癌症的进展程度与N-cadherin呈正相关，与E-cadherin呈负相关[15-17]。基质金属蛋白酶家族(MMPs)经研究证实能够对细胞外基质以及基底膜进行降解，促进肿瘤血管的形成[18]。而基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)能够抑制MMPs的活性，抑制肿瘤的侵袭转移[19，20]。给予以上研究结果，我们发现，STK17A过表达能够抑制TGF-β/SMAD信号通路进而抑制宫颈癌的上皮间质转化。

另外，CCK8、划痕愈合以及细胞侵袭实验证实，过表达STK17A或抑制TGF-β/SMAD信号通路能够抑制Hela细胞活力，减少细胞迁移和侵袭。同时，细胞凋亡实验显示，沉默STK17A表达能够显著抑制Hela细胞的凋亡，而STK17A过表达及TGF-β/SMAD通路抑制剂则能够诱导细胞凋亡且联合处理效果更显著。

综上所述，本研究发现STK17A基因能够作为宫颈癌调控的重要因子，STK17A基因过表达能够显著抑制TGF-β/SMAD信号通路的激活，从而抑制宫颈癌细胞迁移、侵袭，促进细胞凋亡，在宫颈癌中起保护作用。我们的研究证实了STK17A在宫颈癌进展中的关键作用，提示其可作为宫颈癌治疗的重要靶点，但今后仍需要更多的体内和体外实验对其临床价值进行进一步验证。