通心络对脑缺血再灌注大鼠TLR4和NF-κB表达的影响①

李佳佳 朱云波 康玲伶 朱 江

(承德医学院附属医院神经内科，承德 067000)

缺血性脑卒中是危害人类健康的高发病之一，目前缺血性脑卒中的发病机制尚未明了，但研究表明，炎症反应参与缺血性脑卒中的发生与发展，Toll样受体4 (Toll-like receptor 4，TLR4) 通过介导核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)的激活，促进其下游炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α等的表达，从而放大炎症信号[1,2]。通心络是有脉络学说指导组方的中成药，具有活血通络、搜风解痉的功效，是临床上治疗冠心病和缺血性脑卒中的主要用药，大量文献报道通心络可通过保护血管及神经损伤治疗缺血性脑卒中[3,4]，但通心络能否介导TLR4/NF-κB通路对缺血性脑卒中产生疗效尚未报道。故本文旨在建立大鼠脑缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion，I/R)模型，观察不同剂量通心络的药效及具体效用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康雄性SD大鼠50只，4月龄，体质量(300±20)g，由武汉华联科生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(鄂)2018-0028，饲养于清洁级动物房中，自由摄食饮水，适应性喂养7 d后用于后续试验中。

1.1.2试剂与仪器 通心络(石家庄以岭药业股份有限公司，国药准字：Z19989915)，尼莫地平(山东新华制药股份有限公司，国药准字：H10910080)，TUNEL试剂盒(Roche公司)，IL-6、IL-1β及TNF-αELISA试剂盒(美国R&D公司)，Caspase-3、TLR4、p65、p-p65及β-Actin抗体(美国Sigma-Aldrich公司)，HRP标记的山羊抗兔二抗或小鼠二抗(美国Santa Cruz公司)；JS-1075化学发光全自动化学发光图像分析系统(上海培清科技有限公司)；GRME-LUX2-3L光学显微镜(日本Kyowa公司)。

1.2方法

1.2.1模型制备 采用改良Longa法[5]建立脑缺血再灌注模型，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠，仰卧固定；小心开脑，分离出右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉根部，于颈总动脉靠近分叉口处开孔后插入线栓，从颈总动脉通过颈内动脉一直插入到大脑中动脉处；局灶性脑缺血90 min后去掉线栓，进行再灌注。假手术组按照上述方法分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，但不作结扎和插入线栓处理。术后各组大鼠分笼饲养，并注意保温。

1.2.2分组与给药 将50只SD大鼠随机分为5组：假手术组(Sham)、模型组(I/R)、通心络低、高剂量组(0.5 g/kg、2 g/kg)和尼莫地平组(2 mg/kg)，每组10只；造模成功后，通心络按0.5 g/kg、2 g/kg，尼莫地平按2 mg/kg灌胃给药，连续给药10 d；Sham组和I/R组以生理盐水替代。

1.2.3样品采集 收集各组大鼠眼底静脉血2 ml，3 000 r/min离心10 min，取上清即为血清，置于-80℃冰箱保存备用；腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠，快速断头，冰上迅速开颅取脑，置于液氮罐中保存备用。

1.2.4神经功能缺损评分 参照Longa评分对各组大鼠神经功能学进行评价[6]，分值为0～5分，其中无神经缺损症状为0分，不能完全伸展对侧前爪为1分，行走时向偏瘫侧转圈为2分，行走时向偏瘫侧倾倒为3分；不能自发行走、意识受到抑制为4分，死亡为5分。剔除死亡大鼠，并补足各组大鼠数目。

1.2.5脑梗死体积的测量 取出脑组织，以2 mm间距切片，置于0.5%TTC缓冲液中，避光条件下37℃孵育30 min；固定于4%多聚甲醛中，用数码相机拍照，应用软件Image J扫描图片，计算脑梗死区所占百分比(相较于对侧脑体积)。

1.2.6病理学形态检测 取出脑组织置于4%多聚甲醛液中固定4 h，作常规石蜡切片，梯度乙醇脱水后行HE染色，显微镜下观察大鼠脑组织细胞形态的变化。

1.2.7TUNEL检测脑组织中细胞凋亡 取出脑组织作常规石蜡切片，二甲苯浸洗10 min脱蜡，梯度乙醇浸洗，滴加蛋白酶 K增加细胞通透性，37℃下孵育20 min，滴加50 μl TUNEL反应混合液加盖玻片，避光条件下37℃孵育1 h，滴加50 μl converter-POD加盖玻片,避光条件下37℃孵育30 min，加100 μl DAB混合液，室温下反应10 min，苏木素复染3 s后冲洗，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下计数凋亡细胞数目(凋亡的细胞被染色)，随机挑选5个视野(200～500个细胞)计数并拍照。

1.2.8ELISA检测脑组织中血清因子的含量 取出血清样本，参照ELISA试剂盒说明书，检测大鼠血清中白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。

1.2.9Western blot检测脑组织中Caspase-3、TLR4及NF-κB p65的表达 取出脑组织，剪碎后置于RIPA裂解液中匀浆，冰上静置裂解40 min，4℃下9 000 r/min 离心10 min，去上清测蛋白浓度，定量后置于沸水浴中变性10 min；配制SDS-PAGE凝胶，点蛋白样电泳，当溴酚蓝跑至底部时停止电泳，转膜2 h，封闭2 h，分别置于兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、TLR4、p65、p-p65及β-actin抗体(稀释比为1∶1 000)中，4℃孵育过夜；清洗后，加HRP标记的山羊抗兔二抗或小鼠二抗(稀释比为1∶8 000)，室温孵育40 min；应用JS-1075化学发光全自动化学发光图像分析系统进行曝光拍照。应用软件Image J扫描图片，以β-actin为内参，计算Caspase-3、TLR4、p65的相对表达量。

2 结果

2.1通心络对脑缺血再灌注大鼠神经行为学评分和脑梗死体积的影响 与Sham组相比，I/R组大鼠神经行为学评分、脑梗死体积显著升高(P<0.05)；通心络低、高剂量组和尼莫地平组大鼠神经行为学评分、脑梗死体积显著降低(P<0.05)，通心络组具有剂量依赖性，见表1。

2.2通心络对脑缺血再灌注大鼠病理学形态的影响 HE染色如图1所示，Sham组神经元细胞呈圆形，且形态正常、结构完整、排列整齐，细胞内未见水肿、空泡、核固缩现象，无炎性细胞浸润；I/R组神经元细胞呈梭形或三角形，且结构模糊、排列紊乱，细胞间距增大，细胞内出现明显水肿、空泡和核固缩现象，有炎性细胞浸润；相较于I/R组，通心络低、高剂量组和尼莫地平组细胞形态与结构明显改善，周围细胞水肿、空泡和核固缩现象减轻。

2.3通心络对脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞凋亡的影响 如图2所示，与Sham组相比，I/R组大鼠脑组织细胞凋亡数、Caspase-3的表达显著升高(P<0.05)；通心络低、高剂量组和尼莫地平组大鼠脑组织细胞凋亡数、Caspase-3的表达显著降低(P<0.05)，通心络组具有剂量依赖性。

2.4通心络对脑缺血再灌注大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平的影响 如图3所示，与Sham组相比，I/R组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平显著升高(P<0.05)；通心络低、高剂量组和尼莫地平组大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平显著降低(P<0.05)，通心络组具有剂量依赖性。

GroupsNeurologic deficitscoring(Score)Volume ofcerebral infarction(%)Sham0.00±0.000.00±0.00I/R3.14±0.651)34.42±3.521)0.5 g/kg Tongxinluo2.47±1.532)27.45±1.382)2 g/kg Tongxinluo1.62±0.752)21.56±1.152)2 mg/kg Nimodipine1.18±0.512)17.49±0.942)

Note:I/R vs.Sham,1)P<0.05；Tongxinluo,Nimodipine vs.I/R,2)P<0.05.

图1 通心络对脑缺血再灌注大鼠病理学形态的影响(HE,×400，n=5)Fig.1 Effects of Tongxinluo on pathological morphology of rats with cerebral ischemia-reperfusion(HE,×400,n=5)Note: A.Sham；B.I/R；C.0.5 g/kg Tongxinluo；D.2 g/kg Tongxinluo；E.2 mg/kg Nimodipine.

图2 通心络对脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞凋亡的影响(n=5)Fig.2 Effects of Tongxinluo on apoptosis of brain tissues in rats with cerebral ischemia-reperfusion(n=5)Note: A.Sham；B.I/R；C.0.5 g/kg Tongxinluo；D.2 g/kg Tongxinluo；E.2 mg/kg Nimodipine;I/R vs.Sham,#.P P

图3 通心络对脑缺血再灌注大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平的影响(n=5)Fig.3 Effects of Tongxinluo on serum IL-6,IL-1β and TNF-α levels in rats with cerebral ischemia-reperfusion(n=5)Note: I/R vs.Sham,#.P P

图4 通心络对脑缺血再灌注大鼠脑组织中TLR4、NF-κB p65表达的影响(n=5)Fig.4 Effects of Tongxinluo on expression of TLR4 and NF-κB p65 in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion(n=5)Note: A.Sham；B.I/R；C.0.5 g/kg Tongxinluo；D.2 g/kg Tongxinluo；E.2 mg/kg Nimodipine;I/R vs.Sham,#.P P

2.5通心络对脑缺血再灌注大鼠脑组织中TLR4、NF-κB p65表达的影响 如图4所示，与Sham组相比，I/R组大鼠脑组织中TLR4、NF-κB p65表达显著升高(P<0.05)；通心络低、高剂量组和尼莫地平组大鼠脑组织中TLR4、NF-κB p65表达显著降低(P<0.05)，通心络组具有剂量依赖性。

3 讨论

通心络由人参、水蛭、全蝎、土元、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片、檀香、降香、乳香、酸枣仁等组成，可用于治疗气虚血瘀络阻型脑卒中[7]。据报道，通心络可靶向兴奋性氨基酸毒性、钙超载、自由基、炎症反应、细胞凋亡等，保护脑组织细胞[8]，但通心络介导TLR4/NF-κB信号通路对脑卒中的影响报道较少。本研究通过改良Longa法处理大鼠，成功复制脑缺血再灌注(I/R)模型，发现通心络可明显改善I/R大鼠神经行为学评分并减少脑梗死体积，与谭辉等[9]研究结果一致，提示通心络可以缓解缺血再灌注脑损伤。

TLR4是重要的调控先天性免疫功能的效应分子，参与多种疾病的病理生理过程，主要表达于防御功能的细胞中[10]。TLR4通过与接头蛋白髓样分化因子88、白细胞介素相关激酶等结合，激活NF-κB p65和MAPKs信号通路，诱发炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6等)的分泌，最终导致机体过度炎症反应[11]。IL-6、TNF-α是重要的促炎因子，其过度分泌会引起局部炎症反应，损伤器官；IL-1β是主要的炎症调节因子，可以诱导促炎因子的产生，放大炎症信号[12]。通心络胶囊是传统的抗炎中成药，其中人参、冰片、檀香、降香等成分均具有良好的抗炎活性[13,14]，本研究发现通心络可明显减少血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平和脑组织中TLR4 及NF-κB p65的表达，提示通心络可能通过下调TLR4/NF-κB信号，减少IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的分泌，从而降低脑缺血损伤后的炎症级联反应。

此外，TLR4/NF-κB信号通路还参与细胞增殖、分化、凋亡等生理过程[15]。细胞凋亡过程是凋亡相关基因表达的结果，同时受细胞内外多种基因调控，Caspase-3是凋亡过程中重要的执行蛋白[16]。本研究发现通心络可明显下调Caspase-3水平，抑制脑组织细胞的凋亡，起到脑组织保护作用，且高剂量组效果显著，与位庚等[17]报道通心络在受损心肌微血管内皮细胞中的效用相似。

综上所述，通心络可保护脑缺血再灌注对大鼠脑组织产生的损伤，可能与下调TLR4/NF-κB信号通路有关；但本研究仅在动物水平探讨，尚需开展细胞实验作进一步验证。