安卡红曲霉液态发酵豆渣、麦麸、梨渣制备可溶性膳食纤维

孙聪聪 李兴江,2 穆冬冬,2 陈小举 刘淑芸 张 旻,2 潘丽军,2 姜绍通,2 郑 志,2 陈明鑫 吴学凤,2

(1. 安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009；2. 合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009；3. 巢湖学院化学与材料工程学院，安徽 巢湖 238000)

膳食纤维(dietary fiber，DF)对促进消化和排泄具有重要作用[1]。DF包括可溶性膳食纤维(SDF)和不溶性膳食纤维(IDF)，其中SDF具有更优的功能特性[2]。酸法、碱法、酶法、发酵法等是制备SDF的常见方法。酸法和碱法成本低，操作简单，但反应时间长，并会有大量化学残留；酶法制取效果好，可显著提高SDF含量，但成本高，条件严苛，难以实现规模化生产；发酵法是通过微生物对原料中植酸、大分子多糖、蛋白质等的发酵降解作用来改性DF，制备的SDF品质好，且反应过程易于控制和调节，是一种前景良好的SDF制取方法[3]。Chu等[4]采用纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)发酵小米糠，所得SDF与IDF的比例从3.1%增加至19.9%。Jia等[5]利用绿色木霉(Trichodermaviride)发酵脱脂米糠，SDF产率从10.5%增加至33.4%，发酵后脱脂米糠的SDF具有更大的潜力，可用作食品中的功能成分。

安卡红曲霉是红曲霉的一种，在生长过程中能产生多种活性物质，如monacolin K、麦角固醇、红曲色素、酶等[6]。红曲霉发酵会产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶等多种降解酶[7]，发酵液中丰富的蛋白酶和淀粉酶会水解附着在多糖分子表面的蛋白质和淀粉上，增加多糖分子与纤维素酶和木聚糖酶的接触位点，从而增加底物中的膳食纤维含量。而发酵液中的纤维素酶和木聚糖酶活性较高，可使膳食纤维中纤维素和半纤维素氢键断裂，分子链减小，寡糖含量增加[8]。试验拟探索安卡红曲霉在液态发酵过程中代谢产物对豆渣、麦麸、梨渣SDF的得率和水合性能的影响，为解决农产品废渣处理和制备高品质豆渣、麦麸、梨渣SDF提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

豆渣、麦麸、梨渣：每100 g豆渣的碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量分别为61.00，16.50，11.22，3.98，7.30 g；每100 g麸皮的碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量分别为63.40，16.19，9.25，4.16，7.00 g;每100 g梨渣的碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量分别为62.40，12.10，13.85，4.77，6.88 g，所有化学试剂均为国产分析纯。

1.1.2 菌种与培养基

安卡红曲霉(Monascusanka)3.4811：中国通用微生物菌种保藏中心，保存于合肥工业大学安徽省农产品加工重点实验室；

活化培养基：PDA培养基；

种子培养液：3%葡萄糖、1.5%蛋白胨、0.1%七水合硫酸镁、0.3%磷酸氢二钾、100 mL蒸馏水，pH 7.0， 121 ℃灭菌20 min；

发酵培养液：取麦麸、豆渣、梨渣粉200 g，葡萄糖10 g，硫酸铵4 g，用蒸馏水定容1 000 mL，250 mL三角瓶分装100 mL发酵液，115 ℃灭菌20 min。

1.1.3 仪器与设备

超声波清洗仪：GT SONIC-P27型，广东固特超声股份有限公司；

冷冻高速离心机：5804R型，德国Eppendorf公司；

恒温振荡培养箱：HNY-100Y型，恒立国际有限公司；

电热恒温水浴锅：HH2S4型，北京科伟永兴仪器有限公司；

分光光度计：721型，上海菁华科技仪器有限公司；

电子天平：FA2004B型，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 可溶性膳食纤维的制备

(1) 水提法：分别称取10 g废渣粉，加100 mL水，摇匀后静置90 min，超声波处理30 min，8 000 r/min离心15 min，收集上清液，加入4倍体积95%乙醇，4 ℃醇沉过夜，离心(8 000 r/min，15 min)，将沉淀复溶，冷冻干燥得SDF。

(2) 酶法：根据文献[9]略作修改，分别称取10 g废渣粉，加100 mL水进行水浴浸提，95 ℃下加入耐高温α-淀粉酶至上清液碘液测定不变蓝后，冷却至60 ℃加入适量糖化酶反应30 min，再向溶液中加入碱性蛋白酶继续反应30 min，继续加入纤维素酶和木聚糖酶分别于45，55 ℃下水浴30 min，反应结束后，后续方法同水提法。

(3) 发酵法：根据文献[10]略作修改，将发酵培养基高温灭菌后，按一定比例接入红曲霉种子培养液，于28 ℃、160 r/min摇床中培养一定时间后，8 000 r/min离心15 min，后续方法同水提法，分别得豆渣可溶性膳食纤维(OSDF)、麦麸可溶性膳食纤维(BSDF)、梨渣可溶性膳食纤维(PSDF)。

1.2.2 SDF得率的计算 按式(1)计算SDF得率。

(1)

式中：

C——SDF得率，%；

M1——干燥培养皿质量，g；

M2——醇沉后冻干的盛有SDF的培养皿质量，g；

M——底物的干质量，g。

1.2.3 单因素试验 以SDF得率为评价指标，分别考察料液比[1∶5～1∶25 (g/mL)]、接种量(6%～14%)、发酵时间(3～7 d)对红曲霉发酵法制备BSDF、OSDF、PSDF的影响。

1.2.4 多因素优化试验 在单因素试验结果的基础上，选择对试验指标影响显著的因素水平分别进行正交试验和响应面优化试验，以确定较优的制备条件。

1.2.5 SDF性质的测定 根据文献[11-12]的方法分别测定SDF的持水性(WHC)和持油性(OHC)。将0.1 g SDF样品溶于试管中，充分振动摇匀，490 nm处测定其吸光度，以观察SDF的透明度。

根据美国农业部 （USDA）11月报告，由于伊利诺伊州、艾奥瓦州两大大豆主产地减产，2018/2019年度大豆预计单产从53.1蒲式耳/亩下调至52.1蒲式耳/亩，预计产量由上月的1.28亿吨下调至1.25亿吨。尽管预计产量在本月报告中有所下调，但总体增长较为稳定，比去年高出4%，再度创历史新高。

1.3 统计分析

所有试验重复3次，使用SPSS V19.0软件进行统计分析。使用Duncan检验，P<0.05表示统计学显著性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对SDF得率的影响 由图1可知，料液比影响红曲霉发酵法制备OSDF、BSDF、PSDF的得率，对OSDF得率的影响大于BSDF和PSDF的。SDF得率随料液比的增加先增大后趋于稳定。当料液比为1∶5 (g/mL)时，OSDF得率最低，由于豆渣吸水性较高，当料液比较低时，溶液黏度大，不利于菌丝体的生长。当料液比为1∶15 (g/mL)之后，SDF得率的增长趋势变缓。制备SDF需消耗大量的无水乙醇进行醇沉，为节约成本、降低乙醇回收处理量，确定豆渣、梨渣和麸皮的较佳料液比为1∶15 (g/mL)。

图1 料液比对SDF得率的影响

Figure 1 Effect of material-liquid ratio on SDF extraction

2.1.2 接种量对SDF得率的影响 由图2可知，SDF得率随接种量的增加先增加后有所降低，最后趋于稳定。接种量过少时，菌浓度太低，代谢产物少，SDF得率较低；接种量继续增大时，安卡红曲霉菌体量过多，培养液黏度增加，供氧不足，后期红曲霉生长所需营养不足，SDF得率有所降低[13-14]，故最佳接种量为12%。

2.1.3 发酵时间对SDF得率的影响 由图3可知，发酵5 d时，BSDF和PSDF得率最高；发酵6 d时，OSDF得率最高。发酵初期，红曲霉对农产品废渣中的IDF进行降解，使IDF的糖苷键断裂，生成小分子糖转化为SDF，更多的大分子物质得以分解；发酵一定时间后，SDF得率下降，可能是发酵一段时间后，基质被消耗，无法提供红曲霉菌增殖所需的营养物质[15]，微生物开始利用小分子糖，SDF被进一步分解为分子量更小的组分，不易提取。

图2 接种量对SDF得率的影响

图3 发酵时间对SDF得率的影响

2.2 多因素试验结果

2.2.1 BSDF发酵条件优化 以料液比、接种量、发酵时间为因素，以SDF得率为考察指标设计正交试验，因素水平表见表1，试验结果及分析见表2。

由表2可知，BSDF制备工艺各因素的主次顺序是料液比>接种量>发酵时间，较优组合为A2B3C2。由表3可知，料液比和接种量对BSDF得率影响显著，发酵时间对其影响不显著，较优组合为A2B3C1。对上述两种组合进行验证实验(n=3)，A2B3C2得率为5.52%，A2B3C1得率为5.38%。因此红曲霉发酵制备BSDF较优条件为发酵时间6 d，料液比为1∶15 (g/mL)，接种量14%。

表1 正交试验设计因素水平表

表2BSDF制备工艺正交试验设计及结果分析

Table2OrthogonaltestdesignsandresultsanalysisofBSDFpreparationprocess

试验号ABC空列SDF得率/%111111.70212222.70313333.25421233.80522314.16623124.80731323.00832133.30933214.00K17.658.509.809.86K212.7610.1610.5010.50K310.3012.0510.4110.35R5.113.550.610.64

2.2.2 PSDF发酵条件优化 以料液比、接种量、发酵时间为因素，以SDF得率为考察指标设计正交试验，因素水平表见表4，试验结果及分析见表5。

由表5可知，PSDF制备工艺各因素的主次顺序是发酵时间>料液比>接种量，较适组合为A3B3C2。由表6可知，发酵时间和料液比对PSDF得率影响显著，接种量对其影响不显著，较适组合为A3B3C2，对该组合进行验证实验(n=3)，SDF得率为5.42%。故红曲霉发酵制备PSDF较优条件为发酵时间6 d，料液比1∶20 (g/mL)，接种量14%。

2.2.3 OSDF发酵条件优化 以料液比、接种量、发酵时间为因素，以SDF得率为考察指标设计响应面试验，因素水平表见表7，试验结果及分析见表8。

采用Box-Behnken进行多元回归拟合分析，得二次多项回归方程：

Y=8.03-0.26A+0.18B+0.29C+0.12AB-0.065AC+0.43BC-1.93A2-0.52B2-1.43C2。

(2)

利用回归方程对制备OSDF的发酵条件进行优化，可预测OSDF得率的变化[16]。由表9可知，回归模型极显著，表明与实际情况拟合度好；失拟项不显著，表明残差均由随机误差引起，对试验干扰小。3个因素对OSDF得率的影响依次为发酵时间>料液比>接种量，制备OSDF的较优条件为料液比1∶14.67 (g/mL)、接种量13%、发酵时间6.83 d，根据实际情况修正为发酵时间7 d、料液比1∶15 (g/mL)、接种量13%，进行验证实验(n=3)。OSDF得率为8.3%，接近预测值(8.03%～8.50%)，说明采用响应面设计得到的工艺参数真实可信，有较好的指导意义。

表3BSDF制备工艺的方差分析

Table3AnalysisofvarianceanalysisofBSDFpreparati-onprocess

表4 正交试验设计因素水平表

表5PSDF制备工艺正交试验设计及结果分析

Table5OrthogonaltestdesignandresultsanalysisofPSDFpreparationprocess

试验号ABC空列SDF得率/%111113.00212224.44313333.58421234.85522314.39623124.0073134.20832133.80933215.40K111.0212.0510.8012.79K213.2412.6314.6912.64K313.4012.9812.1712.23R2.380.933.890.56

2.3 SDF成分及功能特性分析

由表10可知，发酵法和酶法能显著提高SDF得率，且3种底物发酵法SDF得率均大于酶法。发酵法与水提法相比，蛋白质与脂肪含量降低，即红曲霉在生长过程中利用底物营养成分，得到更高纯度的SDF。经红曲霉发酵后提取的OSDF、BSDF和PSDF的透明度、持水力、持油力都有较明显提高。高透明度说明SDF溶解度高，高持水力和持油力是SDF功能特性的良好体现[17]。由于发酵过程中红曲霉产生的纤维素酶、木聚糖酶等[18]使聚合度高的豆渣、麦麸、梨渣中纤维部分降解成结构松散的小颗粒SDF[19]，增加了溶液与SDF的接触面积，提高了WHC和OHC[20-21]，SDF溶于水后形成胶体。因此，SDF纯度越高，含量越大，持水性越好；发酵过程中，脂肪含量减少，多糖细胞壁被破坏，膳食纤维空隙增多，有利于提高OHC[22]。故红曲霉发酵可有效提高豆渣、麦麸、梨渣SDF的理化性质，是改性豆渣、麦麸、梨渣SDF的有效途径。

表6PSDF制备工艺的方差分析

Table6AnalysisofvarianceanalysisofPSDFpreparati-onprocess

差异源平方和df均方F值显著性A1.18020.59021.07*B0.14720.0742.64C2.59521.29846.36*误差0.05620.028总计3.9788

表7响应面试验设计因素水平编码表

Table7Responsesurfacetestdesignfactorlevelcodingtable

水平A料液比(g/mL)B接种量/%C发酵时间/h-11∶1010501∶1512611∶20147

表8OSDF制备工艺Box-Behnken试验设计及结果分析

Table8Box-BehnkentestdesignandresultanalysisofOSDFpreparationprocess

试验号ABCSDF得率/%11014.5320-1-16.0630008.034-1015.45510-14.0260008.047-1105.7580008.0390008.03100008.0311-10-14.68120116.96131105.74141-105.17150-115.7216-1-105.671701-15.58

表9 回归模型的方差分析及显著性检验†

† **极显著(P<0.01);*显著(P<0.05)。

表10 红曲霉发酵不同底物制备SDF的成分及性质†

† 同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

3 结论

采用安卡红曲霉3.4811对农产品废渣进行发酵，得到最优发酵条件：豆渣发酵时间7 d、料液比1∶15 (g/mL)、接种量13%；麦麸发酵时间6 d、料液比1∶15 (g/mL)、接种量14%；梨渣发酵时间6 d、料液比1∶20 (g/mL)、接种量14%。结果表明，红曲霉发酵可显著提高SDF得率。红曲霉发酵后，SDF纯度更好，具有良好的溶解度、持水力和持油力。与其他方法制备OSDF、BSDF和PSDF相比，红曲霉发酵法优势明显，可广泛应用于食品工业。后续可对红曲霉发酵制备SDF的组分及结构特征进行深入研究，结合红曲霉代谢途径的调控策略研究，进一步提升红曲膳食纤维的品质，为其在食品中的应用提供基础。