基于胶质细胞增殖调控因子bFGF/TGF-β1探讨逍遥散治疗抑郁症的机制＊

刘 燕，吴耀松，杨铁柱，白 娟，寇美静，史占江，陈玉龙＊＊

（1. 河南中医药大学中医药科学院/河南省方证信号传导实验室 郑州 450046；2. 河南中医药大学基础医学院 郑州 450046；3. 河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院） 郑州 450016；4. 河南中医药大学研究生院 郑州450046；5. 湖北中医药大学基础医学院 武汉 430065）

抑郁症（Depression，MDD）是一种以抑郁心境自我体验为中心的临床症状群或状态，主要表现为心情低落、思维迟缓、认知功能障碍、意志行为活动减退、躯体症状等[1,2]。据统计，抑郁症已成为威胁人类健康的第四大疾患。越来越多的研究表明，抑郁症的发生与社会心理应激密切相关。然而，迄今为止，压力应激导致行为障碍的机制仍不清楚。通过本报道资助课题研究以及相关中枢神经病学研究和临床研究报道，大脑皮层和海马是重要的情绪活动调控系统，其功能异常或障碍可能是应激致病的主要原因[2]。

研究显示，抑郁症患者脑内病变主要涉及大脑皮层和海马脑区的星形胶质细胞（astrocytes，AST）形态、功能、可塑性的改变[3]。另外，本团队在上述课题研究的基础上发现抑郁症小鼠模型前额皮质AST 与谷氨酸转运体EAATs 的功能损害既是抑郁症的结果又是促进其发展的重要因素[4]。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是它是正常上皮细胞和星形胶质细胞增殖的强抑制剂。有趣的是，有研究显示TGF-β1 具有调节行为的作用[5]，然而，关于抑郁症的发生中，TGF-β1 的表达变化和作用的报道具有不一致性。有研究显示慢性应激时，海马内注射TGF-β1 能逆转大鼠抑郁行为，又有研究显示抑郁病人血浆中TGF-β1 含量增加[6,7]。碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）表达主要集中于AST 中，其功能主要是促进AST 肥大和增生，是一种重要的促星形胶质细胞活化因子。研究显示前额皮质、海马和纹状体bFGF 表达增强可显著改善抑郁状态[8]。

大量的临床和实验研究表明，宋代《太平惠民和剂局方》中逍遥散在抑郁症治疗方面显示了明显的优越性，关于其治疗机制目前已有大量研究者做出了相关探索，但大部分研究均聚焦于逍遥散对抑郁症患者或模型大脑中枢神经元的调节和保护作用，而从抑郁症患者或动物模型中枢胶质细胞功能开展逍遥散治疗抑郁症机制的研究甚少。本研究基于探索星形胶质细胞抑制和激活因子TGF-β1 和bFGF 的表达进一步证实星形胶质细胞参与抑郁症发生过程，并聚焦于逍遥散对抑郁症小鼠星形胶质的重要调节因子TGF-β1 和bFGF 的调节作用，探讨逍遥散治疗抑郁症的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

于北京维通利华实验动物技术有限公司购买40只 10 周 龄 SPF 级 C57BL/6J 小 鼠（许 可 证 号 ：NO.11400700088123），按照随机数字表法平均分为4组，分别为：正常组，模型组，氟西汀组、逍遥散组，所有小鼠饲养于SPF 级动物房（温度22 ± 2℃，湿度30-40%）。除正常组外，其余各组小鼠均接受CUMS 方法造模。

1.2 实验药物

逍遥散颗粒剂（柴胡30 g，茯苓30 g，白术30 g，当归30 g，白芍30 g，甘草15 g，干姜10 g，薄荷10 g）购于河南中医药大学第三附属医院。盐酸氟西汀胶囊为苏州中化药品工业有限公司产品（规格：20 mg/粒，批号：20064844）。

1.3 给药方法

小鼠给药剂量根据公式（小鼠的剂量=9.1X mg·kg-1，X 代表成人每天服用量/60 kg）换算确定，小鼠每天灌胃体积为0.5 mL，逍遥散和氟西汀的灌胃浓度分别为0.53 g·mL-1和 0.182 mg·mL-1[9]。模型组小鼠以同体积去离子水灌胃。

1.4 试剂与仪器

本研究采用的主要试剂有：bFGF Elisa 试剂盒（CUSABIO，规格：96 T，批号：CEB-E08001m）、TGF-β1 Elisa 试 剂 盒（Multi Science，规 格 ：96T，批 号 ：EK2812）、Anti-FGF2 Anti-body（No. ab10419，abcam公司）、Anti-TGF-β1 Anti-body（No.3711，CST 公司）。主要检测的仪器有universal Hood II 型全自动化学发光成像分析系统；power pac 1000 型电泳仪；GS-800 型分光光度计。

1.5 动物模型的建立

根据文献报道，采用抑郁症模型建立常用的慢性不可预知性温和应激方法[10]造模。对各组小鼠体重、摄食量进行监测，并采用旷场试验和糖水偏好实验对各组小鼠行为学进行评价。自造模第1天开始于接受造模刺激前1 h灌胃。

1.6 动物一般情况和行为学检测

1.6.1 体重测量

每日于灌胃前称量并记录各组小鼠体重、摄食量。

1.6.2 糖水实验

根据文献报道的实验步骤[11]，实验前，先训练小鼠适应含糖饮用水，实验开始时，每只小鼠预先给予一瓶1%蔗糖水和一瓶纯净水，1 h 后，取两瓶并称重以计算动物中糖和纯水的消耗量（蔗糖偏好=蔗糖水消耗量/总耗水量× 100%）。糖水实验于造模第21 天进行。

1.6.3 强迫游泳实验

实验第1天，将小鼠放入圆柱形玻璃桶中（注水高度20 cm；温度22 ± 1℃）游泳15 min。第2 天，将小鼠放入同条件的圆柱形玻璃桶中游泳6 min，并使用视频测量不动时间6 min。在最后5 min 内，由对设计不知情的实验者记录每只小鼠的不动持续时间。该实验在造模的第21天进行。

1.7 Elisa方法检测逍遥散对抑郁小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1的总蛋白水平的影响

以反复冻融法裂解各组前额皮质标本，按说明书，加入标准品和待测样本（100 mL/孔），并逐步加入抗体工作液、洗液、底物溶液和终止液，于酶标仪450 nm波长条件下检测各孔OD 值。使用Curve Expert 1.3 软件并求出各样本的实际蛋白浓度。

1.8 免疫组化方法检测逍遥散对抑郁症小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1蛋白免疫活性的影响

将4%多聚甲醛固定的小鼠脑组织以石蜡包埋，5 μm厚度连续切片，每个脑组织随机挑取3 张切片进行免疫组化检测。切片经抗原修复和内源性过氧化物酶灭活后，BSA 封闭后，滴加抗 bFGF 和 TGF-β1 兔多克隆抗体（均按1∶1000 比例稀释）室温条件下孵育1 小时后，滴加二抗，室温孵育20 min，PBS浸洗，经DAB显色，复染、脱水、透明后，以中性树脂封片。采用Court&Measure Full cellSens 1.11系统对切片进行管擦并计算bFGF和TGF-β1阳性细胞数和OD值。

1.9 western blotting 方法检测逍遥散对抑郁症小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1蛋白的表达水平的影响

BCA 法测定总蛋白浓度后，按照文献[2]报道的western blotting 方法检测各组小鼠前额皮质bFGF 和TGF-β1 蛋白的表达水平，并采用GIS1D 4.2 图像分析软件对图像灰度值进行采集，并求出bFGF 和TGF-β1受体蛋白的相对表达量。

1.10 统计学方法

采用SPSS20.0 统计软件对数据进行分析，以均数±标准差（）对结果进行描述。符合正态分布检验和组间方差齐性检验的数据，采用One-Way ANOVA进行统计处理，组间比较采用LSD 检验，以P＜0.05 作为统计学意义界限。

2 实验结果

2.1 逍遥散对抑郁症模型小鼠体重和摄食量的调节作用

从表1 可知，模型组小鼠体重和摄食量较正常小鼠均出现明显的下降（P＜0.01），然而，经逍遥散和氟西汀治疗后，小鼠体重（P＜ 0.05，P＜ 0.05）和摄食量（P＜ 0.01，P＜ 0.05）均出现明显增长。

2.2 逍遥散对抑郁症模型小鼠行为学变化的调节作用

从表2可知，与正常比较，模型组小鼠糖水偏好显著减弱（P＜0.01），强迫游泳5 min 内不动时间显著增加（P＜0.01）。逍遥散和氟西汀可使模型小鼠糖水偏好显著增加（P＜ 0.01，P＜ 0.01）；使强迫游泳5 min 内不动时间显著减少（P＜ 0.01，P＜ 0.01）。

2.3 逍遥散对抑郁症小鼠前额皮质bFGF 和TGF-β1总蛋白含量的影响

从表3可以看出，模型小鼠前额皮质bFGF含量较正常组下降趋势显著（P＜0.05），而经逍遥散和氟西汀治疗后，模型小鼠前额皮质bFGF 含量显著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。相反的是，模型组小鼠前额皮质TGF-β1 的含量较正常组显著上升（P＜ 0.01），而经逍遥散和氟西汀治疗后，模型小鼠前额皮质TGF-β1 的含量显著上升（P＜ 0.01）。

表1 各组小鼠体重和摄食量变化

表2 各组小鼠糖水偏好和强迫游泳行为变化

表3 各组小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1含量的统计学描述()/pg·mg-1

表3 各组小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1含量的统计学描述()/pg·mg-1

注：*：与正常组比较：P ＜ 0.05，**：与正常组比较P ＜ 0.01；△：与模型组比较P ＜ 0.05，△△：与模型组比较P ＜ 0.01；

TGF-β1 9.56±0.67 16.06±2.84**11.36±1.51△△10.18±1.31△△组别正常组模型组逍遥散组氟西汀组bFGF 5.62±0.60 3.35±1.03*5.43±1.59△5.87± 0.71△△

表4 各组小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1蛋白免疫组化OD值及阳性细胞数的统计学描述()

表4 各组小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1蛋白免疫组化OD值及阳性细胞数的统计学描述()

注：*：与正常组比较：P ＜ 0.05，**：与正常组比较P ＜ 0.01；△：与模型组比较P ＜ 0.05，△△：与模型组比较P ＜ 0.01

阳性细胞数/n 217.42±61.65 283.92±86.31*202.75± 45.10△△195.83± 81.54△△组别正常组模型组逍遥散组氟西汀组bFGF OD值2.76±0.66 1.75±0.55**2.50± 0.53△△2.29±0.66△阳性细胞数/n 268.53±66.32 179.00±43.80**226.17±39.22△220.92±44.58△TGF-β1 OD值1.59±0.52 2.90±0.48**1.88± 0.53△△1.78± 0.43△△

2.4 逍遥散对抑郁模型小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1的蛋白表达的影响

2.4.1 免疫组化技术检测结果

图2 各组小鼠前额皮质TGF-β1蛋白免疫组化检测结果

表5 各组小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1蛋白表达的统计学描述（）

表5 各组小鼠前额皮质bFGF和TGF-β1蛋白表达的统计学描述（）

注：*：与正常组比较：P ＜ 0.05，**：与正常组比较P ＜ 0.01；△：与模型组比较P ＜ 0.05，△△：与模型组比较P ＜ 0.01

TGF-β1 1.40±0.32 2.32±0.92**1.49±0.19△1.36±0.13△△组别正常组模型组逍遥散组氟西汀组bFGF 1.63±0.30 0.90±0.36**1.46±0.44△1.46±0.45△

从表4 和图1 可见，模型组小鼠前额皮质bFGF 蛋白阳性细胞数和OD 值与正常组比较显著减少（P＜0.01），与模型组比较，逍遥散和氟西汀治疗组小鼠前额皮质bFGF 蛋白阳性细胞数和OD 值显著增加（P＜0.05，P＜ 0.01）。从表4和图2可见模型组小鼠TGF-β1蛋白OD 值和阳性细胞数较正常组显著增加（P＜0.05），经逍遥散和氟西汀治疗后，小鼠 TGF-β1 蛋白OD值和阳性细胞数显著降低（P＜0.01）。

2.4.2 Western blot技术检测结果

图3 各组小鼠前额皮质TGF-β1蛋白表达情况

图4 各组小鼠前额皮质bFGF蛋白表达情况

从表5 和图3-4 可知，模型组小鼠前额皮质bFGF蛋白表达量较正常小鼠显著减少（P＜0.01），而经逍遥散和氟西汀治疗后bFGF 表达显著升高（P＜0.05）。而各组小鼠TGF-β1 的表达情况与bFGF 相反，组间差异显著（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。

3 讨论

抑郁症的发生与慢性应激密切相关。不良应激会产生多种有害物质，从而引起机体一系列应激症状，如消极、适应能力低下、泄泻、体重降低、饮食减少等[12]。机体在应激状态下，可通过各种代偿机制应对，并引起一系列神经生化、内分泌和免疫等系统的稳态改变，其中参与应激反应的脑区主要有海马、下丘脑、前额皮质、杏仁核、纹状体等，其中前额皮质和海马是应激反应过程中承受刺激最大、受损最严重的脑区[13]。

本研究结果显示21 天慢性不可预知性温和应激可使小鼠体重、摄食量减少，糖水偏好减少，强迫游泳5 min 内不动时间增加，且逍遥散对模型小鼠出现体重、摄食量、行为学等的变化有显著的治疗作用，以上研究结果与同类研究结果[14]相吻合，说明慢性不可预知性温和应激可使小鼠出现明显抑郁症状。

bFGF 是成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）家族中组成成员之一，是神经胶质细胞和雪旺细胞的促有丝分裂原，能促进细胞增殖，另外bFGF 作为一种天然的神经保护因子，有维持神经细胞存活的功效[15]。有文献报道，外源性的bFGF可改善大鼠空间学习记忆能力，小鼠接受急性应激后，前皮层中bFGF的表达明显上调[16]。本研究观察到，抑郁症模型小鼠前额皮质bFGF 蛋白表达显著上升，而经逍遥散和氟西汀治疗bFGF 表达下调。表明抑郁症小鼠自发行为和空间记忆功能的改变与bFGF 在前额皮质表达变化密切相关，且逍遥散和氟西汀对此改变有一定的扭转作用。

转化生长因子（TGF-β1）不仅在炎症反应、免疫反应和组织损伤中发挥着重要作用，还能发挥对神经系统的保护作用，研究表明在抑郁症发生中，TGF-β1 具有调节行为的作用[17]，且在CUMS 大鼠模型海马组织内检测到TGF-β1 的表达显著升高，硒蛋白P 表达下降，且正常和CUMS 大鼠注射外源性TGF-β1 能明显抑制硒蛋白 P 的表达，表明 TGF-β1 通过 TGF-β1 型受体抑制硒蛋白P 表达可能是导致抑郁发生的途径之一[18]。本研究观察到，抑郁症模型小鼠，前额皮质TGF-β1 蛋白表达显著增加，经逍遥散和氟西汀治疗后均下调，表明TGF-β1 蛋白在抑郁症发生中扮演着重要的角色。

另外，本研究团队前期研究显示AST 功能损害与抑郁症的发生密切相关，且逍遥散可能通过调节抑郁症AST 功能而发挥其治疗作用[4]。而本研究观察到逍遥散可通过调控AST 抑制剂TGF-β1 和促活化剂bFGF 而发挥治疗抑郁症的作用，其机制可能与逍遥散通过bFGF/TGF-β1 调控前额皮质AST 功能有关，但具体机制仍需进一步深入研究。