脾气虚大鼠胃黏膜细胞线粒体自噬相关蛋白表达的研究＊

刘璐菘，刘文俊，许欣竹，马 丹，王凌志，于化新，刘慧慧，单德红

（1. 辽宁中医药大学动物实验中心 沈阳 110847；2. 辽宁中医药大学教学实验中心 沈阳 110847；3. 辽宁中医药大学中西医结合学院 沈阳 110847）

传统中医理论认为脾胃相表里，脾气虚时胃气亦虚，因此胃主受纳和腐熟水谷等功能也会受损。现代医学认为，胃黏膜存在主细胞、壁细胞和G 细胞等多种内、外分泌细胞，其合成释放的胃液和多种胃肠激素广泛参与消化吸收。研究发现，脾气虚时胃酸、胃蛋白酶原、胃泌素、胃动素和血管活性肠肽等分泌减少[1-5]，胃黏膜细胞的线粒体损伤[6,7]。由于线粒体在胃液和胃肠激素的合成与释放中发挥重要作用[8,9]，因此其损伤与脾气虚胃黏膜细胞的内、外分泌功能下降有关，但其损伤机制不明。

线粒体为网状细胞器，对外来刺激极为敏感，但细胞可启动线粒体自噬机制，及时清除异常个体，从而维护其网络健康。线粒体产能主要依赖于呼吸链复合物（respiratory chain complex，RCC）的氧化磷酸化，其副产品还有线粒体膜电位（ΔΨm）。5 种RCC 中的4种由线粒体DNA和核DNA 共同编码，但前者易突变，常导致部分线粒体ΔΨm 下降，但细胞可通过PTEN 诱 导 激 酶 1（PTEN-induced putative kinase protein 1，PINK1）-Parkin 通路，启动线粒体自噬机制，及时识别并隔离异常线粒体，进而为溶酶体降解清除[10]。线粒体自噬过程复杂，受众多自噬相关蛋白严密调控，因此某些关键蛋白表达常用来评价其发生水平，如微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）-II 和选择性自噬接头蛋白p62 等[11]。本研究主要采用电镜和分生等技术，围绕线粒体超微结构、呼吸链状态和自噬等，探讨脾气虚胃黏膜细胞线粒体损伤的可能机制。

1 材料

1.1 动物

将SPF 级雄性SD 大鼠，体质量（220 ± 10）g，共计16 只，购自本溪长生生物技术有限公司（许可证号：SCXK（辽）-2010-0001），适应性饲养（室温（22 ±1）℃，相对湿度45%-55%，自由进食水）1周后复制脾气虚证动物模型。本研究方案通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审核（20151205）。

1.2 伦理审查

项目通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审核，批准号：20151205。

1.3 试剂

线粒体呼吸链复合物I-IV 检测试剂盒（批号：20171120，Solarbio）、BCA 法蛋白测定试剂盒、EasySee Western Blot 发光液（批号：K20316、10419，TransGen）、ATP 含量测定试剂盒（批号：201901，南京建成生物工程研究所）、抗RCC V多克隆抗体和抗p62多克隆抗体（批号：00007313，00010203，Proteintech）、抗 PINK1 多克隆抗体和抗Parkin多克隆抗体（批号：GR248843-1，GR281377-1，Abcam）、抗LC3-II 多克隆抗体（批号：00040972，Proteintech）、GAPDH（ 批 号 ：20817，TransGen）。

1.4 主要仪器

酶标仪（美国，iMark），蛋白印迹和和电泳仪（美国，Bio-Rad）、高速冷冻离心机（美国，Thermo Scientific）、显影仪（中国，Tanon）。

2 方法

2.1 分组、模型复制及评价

大鼠按照随机数字表法分为正常组和脾气虚证模型组（模型组），每组8 只。按文献[12]复制和评价饮食失节+劳倦型脾气虚证大鼠模型。

2.1.1 模型建立

模型组在15日内①先饱食1日，再禁食2日，不禁水，共5个循环；②每日水温35-37℃游泳至力竭。

2.1.2 模型评价标准

①消瘦：体质量明显下降为达标；②食少：代谢笼计量24 h 单只进食量和饮水量，均明显减少为达标；③神疲：检测大鼠5 min 内在旷场实验中的运动距离和站立次数，显著下降为达标；④乏力：四肢抓力明显变小为达标。⑤毛发枯槁：三人分别判断，结论一致为达标。

2.2 胃黏膜细胞线粒体超微结构观察

二组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.0035 mL·g-1）麻醉，剖腹取胃，4℃盐水洗净，部分切成约1 mm3，按文献方法[13]处理后，电镜观察胃黏膜细胞线粒体的超微结构变化并拍片，每例计数6 个不同视野下嵴减少的线粒体数量。

2.3 胃黏膜细胞线粒体呼吸链状态评价

同2.2 法取洗净后胃组织，分离胃黏膜层并置于线粒体保护液中，玻璃匀浆器充分匀浆后离心（1 kg，5 min，4℃），弃除沉淀，将上清同法再次离心，吸取上清再次离心（1.2 kg，10 min，4℃），向沉淀物中加入100 μL预冷PBS（pH7.4）制成线粒体混悬液；其次，采用JC-1法，将线粒体悬液与JC-1 冲洗缓冲液混合，用红色荧光/绿色荧光比值表示ΔΨm；最后，取线粒体悬液，按文献采用比色法检测ATP 和呼吸链RCCI-IV 活性[14]。所有操作均严格按照说明书操作。

2.4 相关蛋白表达

参照文献所载Western blot 检测方法[15]，简述如下：剪碎胃黏膜组织后加入线粒体蛋白裂解液，冰浴充分匀浆后静置30 min，离心（1.4 kg, 10 min, 4℃）取上清；BCA 蛋白定量，以25 μg 上样调整并计算加样量；2 × SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液100℃煮沸5 min，加样，10%分离胶SDS-PAGE 电泳90 min；转膜；5%脱脂奶粉/TBST 室温封闭1 h；分别加入RCCV（1∶2000）、PINK1（1∶1000）、Parkin（1∶1000）、LC3-I（1∶5000）、LC3-II（1∶2000）和 p62（1∶2000）及 GAPDH（1∶5000）等抗体，4℃摇床16 h；TBST 洗膜后二抗室温孵育1 h；TBST 洗膜后加入发光显影，应用AlphaView SA 软件计算目的条带相对于内参的表达量，再计算模型组相对于正常组表达量的百分比（除CV），以方便制图。

2.5 数据处理

3 结果

动物模型复制过程中未有死亡及脱失。通过模型评价发现模型组大鼠均出现体质量下降、进食减少、神疲乏力以及毛色枯槁无华等，实验结果表明动物模型复制成功[13-15]。

图1 二组胃黏膜细胞线粒体超微结构变化

表1 二组胃黏膜细胞线粒体嵴减少线粒体数量()

表1 二组胃黏膜细胞线粒体嵴减少线粒体数量()

注：与正常组比较，**P ＜ 0.01。

嵴减少线粒体数/个1.90±0.45 6.43±2.29**组别（n=3）正常组模型组

3.1 胃黏膜层线粒体形态

图1可见，二组均可见较多卵圆形线粒体，轮廓清楚，大小比较一致，内部的嵴较清晰，但模型组可见大量嵴减少现象（见图1 中*），二组嵴减少线粒体数量见表1。

3.2 胃黏膜细胞线粒体呼吸链基本状态

表 2 可见，与正常组比较，模型组 ΔΨm 和 ATP 水平下降，CI 和CIV 活性及CV 表达降低，均有统计学意义，但RCCII和III活性变化不明显，无统计学差异。

3.3 胃黏膜细胞线粒体自噬相关蛋白表达

图2可见，模型组PINK1、Parkin、LC3-I、LC3-II和p62 表达分别为正常组的 68.69% ± 0.84%，72.67% ±4.74%，134.16% ± 2.27%，69.61% ± 3.07%，121.83% ±4.65%，其中PINK1、Parkin 和LC3-II表达水平下降，而LC3-I和p62表达升高，均有统计学意义。

4 讨论

线粒体是网状细胞器，不仅是细胞的动力工厂，对于胃肠道的内、外分泌细胞内来说，还协同高尔基体和内质网等完成胃蛋白酶原和多数激素的合成、储存与释放，而其损伤又会诱发氧化应激和细胞凋亡，因此胃黏膜细胞线粒体健康对于消化吸收影响极大[16]。

脾气虚胃黏膜细胞线粒体结构损伤早有报道[6-7]，本研究也观察到类似现象，如模型组线粒体嵴明显减少。由于线粒体产能依赖于其内膜嵴上的呼吸链的氧化磷酸化反应，所以本研究进一步检测了该类细胞线粒体呼吸链的基本情况。结果显示，模型组的ATP和 ΔΨm 水平明显降低，且 RCCI 和 IV 活性及 RCCV 表达降低，表明脾气虚时胃黏膜细胞线粒体的呼吸链功能受损，此结果还未见报道。线粒体RRCI、III、IV和V均由线粒体DNA 和核DNA 共同编码，但前者靠近氧化磷酸化场所，又缺少修复机制，极易为外来刺激所诱导而发生突变，从而干扰呼吸链功能，如不及时纠正，则会导致诸如ΔΨm下降和ATP合成减少等结果。

正常情况下，功能异常的线粒体可以分裂为健康和异常子代各一，前者融入原有网络能够维持线粒体的数量和质量，而后者则应及时清除，否则将污染原有网络，甚至发生氧化应激和细胞凋亡，因此及时降解异常线粒体个体就显得极为重要[17]。线粒体自噬是细胞清除异常线粒体的重要机制，其介导途径较多，目前研究较多的是PINK1-Parkin 通路[18]。研究显示，ΔΨm 正常的线粒体可将胞浆中的PINK1 转运入线粒体内分解，而ΔΨm 下降会阻碍该过程，造成PINK1 堆积于线粒体外膜，再通过一些中间环节募集Parkin，从而促进异常线粒体被吞噬泡所包裹而形成自噬体，最终被溶酶体分解[19]。本研究结果显示，模型组的ΔΨm下降，但PINK1和Parkin表达均明显低于正常组，表明脾气虚时胃黏膜细胞的PINK1-Parkin 通路抑制。通常来说，ΔΨm 下降会导致PINK1 表达上升，但本研究中模型组PINK1 表达却出现降低，推测可能是脾气虚时胃黏膜细胞内的PINK1 合成减少，或是线粒体转运PINK1的机制增强，具体原因将在以后探讨。

表2 二组胃黏膜细胞线粒体呼吸链情况()

表2 二组胃黏膜细胞线粒体呼吸链情况()

注：与正常组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

RCCV表达(n=4)0.70±0.09 0.36±0.11**组别正常组模型组ΔΨm(n=8)0.81±0.27 0.59±0.080**ATP（μmoL·g-1）(n=8)0.18±0.09 0.11±0.01**RCCI活性(n=8)15.27±4.76 12.61±4.09*RCCII活性(n=8)16.98±6.02 18.14±5.50 RCCIII活性(n=8)12.43±3.62 14.10±5.92 RCCIV活性(n=8)33.72±11.34 18.21±3.93**

图2 胃黏膜细胞线粒体自噬相关蛋白表达

线粒体自噬因受众多蛋白调控，所以部分蛋白表达水平可用来判定自噬的强弱。LC3-II 由LC3-I 转化，主要表达于吞噬泡和自噬体的膜上，是最常用的自噬评价指标[20]。p62与LC3结合，常在自噬发生后被降解，因此可与LC3-II 配合反映自噬水平[21]。本研究结果显示，与正常组相比，模型组LC3-I 表达较高，LC3-II 表达下降，而 p62 表达上升，分别提示 LC3-I 转化为LC3-II减少和p62降解不足，由此推测，脾气虚时胃黏膜细胞的线粒体自噬水平降低，可能难以及时清除异常的线粒体个体，从而导致整个网络损伤。

综上所述，本研究认为脾气虚胃黏膜细胞线粒体结构和功能损伤与PINK1-Parkin 通路抑制所导致的线粒体自噬水平低下有关。