基于HPLC与化学计量学方法的防风标准汤剂质量研究＊

张 良，罗 沙，况 玉，魏 屹，谭 睿＊＊

（1. 西南交通大学医学院 成都 610031；2. 西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031）

防风，最早收载于《神农本草经》，列为草部上品[1]，为风病要药，功能祛风解表，胜湿止痛，因其能抵御风邪，固有防风之名。今以干燥根入药，主要产收于我国东北及内蒙古东部[2]。现有研究表明，防风中的成分主要分为为色原酮类、香豆素两大类，具有镇静、抗炎、抗菌、抗惊厥、抗肿瘤、镇痛等药理作用[3-7]。

当前我国中药饮片种类多样，并存在多种中药饮片用药形式，包括配方颗粒、精制饮片、超微饮片、破壁饮片等。同时，受制备工艺的影响，不同生产厂家的产品差别大，致使中药饮片质量标准不够明确，临床用药剂量难以规范。急需建立规范的可用于标化不同饮片用药形式和不同厂家产品的标准，以提高临床用药的准确性和疗效的一致性。陈士林[8]等提出，通过建立中药饮片标准汤剂标准体系，规范目前临床广泛使用的包括配方颗粒在内的新型饮片形式，保障用药的准确性和剂量的一致性，解决目前饮片形式多样带来的监管困境。近几年来，已有包括白芍、赤芍、当归、党参、甘草、葛根、桂枝等数十种中药饮片标准汤剂的研究[9-15]。杨立伟[16]等通过建立甘草配方颗粒标准汤剂的指纹图谱，对6 家企业的甘草配方颗粒产品进行了比较，有效确定其质量的差异性。成颜芬[17]等采用指纹图谱、聚类分析（cluster analysis，CA）和多指标成分含量测定相结合，从整体定性和指标成分定量的角度，标定川芎饮片标准汤剂的化学轮廓和质量控制。

目前，对防风的研究集中在伪品鉴别，药理作用，活性成分等，曹文正等[18]对11 批防风饮片标准汤剂的升麻素苷，5-O-甲基维斯阿米醇苷进行质量标准探究，但选取的样本总量少，选取的特征成分未能阐明不同产地间防风饮片的质量差异，也未能进一步研究样品差异的影响因素。本研究采集15 批防风饮片标准汤剂指纹图谱信息，结合化学计量学方法，通过CA分析其质量概貌与产地间存在的关联性，主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）筛选得到导致不同防风标准汤剂之间有差异而分类的标志性化学成分，同时建立其含量测定方法。测定15 批防风饮片标准汤剂的4 种主要成分的转移率，干膏得率和pH 值，为防风标准汤剂的质量标准研究及应用提供依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（Agilent 型，安捷伦公司），1/10万电子分析天平（CPA225D 型，赛多利斯科学仪器有限公司），pH 计（pH-100A 型，力辰科技公司），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为111710-200602、111522-201712、111523-201610，纯度均 ＞ 96%）；亥茅酚苷对照品（成都普菲德公司，批号：190110-013，纯度 ≥99%），甲醇为HPLC 级（美国Fisher 公司），水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

15 批防风分别采购于河北安国（批号1710131-1710135）、河南安阳（批号FF180311-FF180315）、内蒙赤峰（批号FF180321-FF180325），依次编号为FF-1-FF-15。经西南交通大学宋良科教授鉴定为伞形科植物Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipes Plus C18色谱柱（4.6 ×250 mm，5 μm），流速为1 mL·min-1，流动相甲醇（A）-水（B）梯度洗脱（0-5 min，10%A；5-15 min，10%-36%A；15-20 min，36%-40%A；20-35 min，40%-50%A；35-40 min，50%-60%A；40-47 min，60%-67%A；47-55 min，67%-80%A；55-60 min，80%-100%A），柱温30℃，进样量10 μL，检测波长254 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液

取5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素苷、升麻素，甲醇为溶剂，制得质量浓度为409、413、430、541 μg·mL-1的对照品母液。

2.2.2 防风标准汤剂

称取防风饮片约100 g，加7 倍量水，静置30 min，充分润透，于圆底烧瓶中加热回流60 min，纱布滤过；残渣倒回圆底烧瓶，以6 倍量加热回流40 min，过滤，将两次所得滤液合并，60℃减压浓缩至500 mL，得防风饮片标准汤剂。精密吸取防风饮片标准汤剂1 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超声10 min，摇匀，滤过，取续滤液。

2.2.3 防风供试品溶液

取防风饮片细粉约0.25 g，精密称定，精密加入甲醇10 mL，称定重量，水浴回流2 h，放置冷却后，以甲醇补足重量，摇匀过滤，取续滤液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取批号FF180322防风，供试品溶液按“2.2.2”项下方法制备，色谱条件按照“2.1”项下，重复进样6 次，以5-O-甲基维斯阿米醇苷（6 号峰）为参照峰，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 值均低于0.14%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取批号FF180322 防风6 份，供试品溶液按“2.2.2”项下方法制备，色谱条件按照“2.1”项下，进样检测，以5-O-甲基维斯阿米醇苷（6 号峰）为参照峰，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 值均低于0.47%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取批号FF180322防风，供试品溶液按“2.2.2”项下方法制备，放置0、4、8、12、16、20、24 h 后分别以“2.1”项下色谱条件进样，以5-O-甲基维斯阿米醇苷（6 号峰）为参照峰，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 值均低于0.36%，表明该供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4 指纹图谱建立及化学模式识别

2.4.1 HPLC指纹图谱建立

图1 15批次防风标准汤剂HPLC指纹图谱及对照指纹图谱（R）

图2 防风标准汤剂的CA结果

按“2.2.2”项下方法制备15 批次防风饮片标准汤剂供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件检测，采用2012A 版中药色谱指纹图谱相似度评价系统，利用中位数法，时间窗宽度设置为0.5 min，设定FF-12 为参照色谱，经全谱峰匹配后标定了8个共有峰，其共有峰峰面积占总峰面积的69.19%-90.87%。指认出其中4个共有峰，其中4、5、6、8 号峰分别对应、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷。15批防风标准汤剂指纹图谱及其生成的对照指纹图谱（R）见图1。

2.4.2 CA

CA 常用于探究不同数据源间的相似性。采用SPSS 22.0 软件对15 批样品进行CA，以8 个共有峰的峰面积为变量，选用WORD 连接法，平方欧氏聚类距离为指标，见图2。结果发现当判别距离为6 时，可大致为3 类，即样品S1-S5 归为一类，样品S6-S10 为一类，样品S11-S15为一类，CA 结果表明，各批次防风样品与产地间存在一定的关联性，来自同一产地的防风饮片被归为一类，其药材质量较为稳定，不同产地的划分为不同类别，其质量概貌存在差异。

表1 防风标准汤剂的特征值和方差贡献率结果

2.4.3 PCA

PCA 通过降维处理，在保持原始数据信息的基础上，简化目标信息。将15批次防风饮片标准汤剂的共有峰数据导入SPSS 22.0软件，计算特征值和方差贡献率。结果见表1，其中两个主成分特征值大于1，对方差的累计贡献率为85.82%，说明这两个主成分在反映不同来源的样品质量差别关系中起主导作用。图3为PCA碎石图，第二个主成分后，曲线坡度变缓，同样说明这两个成分是评价样品质量的代表性变量。因此，可将防风标准汤剂的多个成分简化为2个主成分进行分析。

图3 主成分碎石图

图4 15批次样品PLS-DA得分图

2.4.4 PLS-DA

CA 的结果将防风饮片标准汤剂分为3类，在此基础上，进行PLS-DA 分析，结果见图4。3 组样品聚类良好，分离显著。采用变量重要性投影（VIP）法分析，对7个差异性标志物进行影响作用排序，见图5。其中4个标志物VIP 大于1，其影响程度依次为峰3 ＞峰6 ＞峰 4 ＞ 峰 5，经指认，其中6 号峰、4 号峰、5 号峰分别为5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、升麻素。

2.5 防风饮片标准汤剂中多指标成分的含量测定

2.5.1 线性关系考察

图5 15批次样品VIP得分图

准确吸取“2.2.1”项下对照品母液，以甲醇为溶剂，制成质量浓度分别为9.695 1、38.780 5、48.475 6、96.951 3、145.426 9、169.664 8 μg·mL-1的升麻素苷对照品溶液；1.464 5、5.857 9、14.644 8、18.306 1、21.967 3、25.628 5 μg·mL-1的升麻素对照品溶液；11.308 1、22.616 1、56.540 3、113.080 7、169.621 1、197.891 3 μg·mL-1的5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液；0.655 5、1.310 9、3.277 4、6.554 9、9.832 3、11.471 1 μg·mL-1的亥茅酚苷对照品溶液。色谱条件按照“2.1”项下，以样品浓度对峰面积进行线性回归，结果见表2。

2.5.2 精密度试验

取批号FF180322防风标准汤剂的供试品溶液，色谱条件按照“2.1”项下，连续进样6 次，结果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的RSD 分别为0.44%、0.09%、0.41%，0.41%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验

平行制备6 份防风饮片（批号FF180322）标准汤剂的供试品溶液，色谱条件按照“2.1”项下，结果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的RSD 分别为1.29%、1.33%、1.69%、1.95%，表明该方法的重复性良好。

2.5.4 稳定性试验

取批号FF180322 防风饮片标准汤剂的供试品溶液，色谱条件按照“2.1”项下，分别在0、4、8、12、16、20、24 h进样，结果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的RSD 分别为0.79%、0.26%、0.85%、0.78%，表明供试品溶液在制备后的24 h 内稳定。

表2 线性关系考察

图6 样品含量测定HPLC色谱图

2.5.5 加样回收试验

平行制备6 份防风（批号FF180322）饮片标准汤剂供试品溶液（指标成分浓度分别为升麻素苷22.530 4 μg·mL-1、升麻素3.673 8 μg·mL-1、5-O-甲基维斯阿米醇苷29.017 7 μg·mL-1、亥茅酚苷1.679 8 μg·mL-1），等量添加对照品，按“2.1”项下色谱条件测定，计算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷的平均加样回收率分别为97.25%、103.93%、103.16%、106.11%，RSD 分别为3.54%、3.61%、2.87%、1.88%，表明该方法准确可靠。

2.5.6 样品测定

取15批次防风饮片，供试品溶液按照“2.2.2”项下方法制备，色谱条件按照“2.1”项下，计算各指标成分的含量，结果见图6和表3。

2.5.7 防风饮片标准汤剂量值传递评价指标的测定

转移率=标准汤剂中指标成分质量/饮片中指标成分质量× 100%，分别计算15 批次防风饮片标准汤剂中升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷，亥茅酚苷的转移率。出膏率=总浸膏质量m/饮片质量M×100%。防风饮片标准汤剂的pH用pH计测定三次，取均值（表3）。

3 讨论

在对防风饮片标准汤剂指纹图谱色谱条件优化的过程中，比较了不同厂家的色谱柱，考察了Waters Sunfire C18（4.6 × 250 mm）、Agilent ZORBAX Eclipes Plus C18（4.6 × 250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna Su C18（4.6 × 250 mm），结 果 表 明 Agilent ZORBAX Eclipes Plus C18 色谱柱柱效好，理论塔板数高。筛选了流动相的组成，考察甲醇-水，乙腈-水不同体系，结果表明甲醇-水作为流动相得到的色谱图分离度较好。比较不同柱温，最终选择柱温为30℃。

表3 防风饮片和标准汤剂的成分含量转移率及理化参数

参照标准汤剂的要求，本研究制备15批防风饮片标准汤剂，建立了HPLC 指纹图谱，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A 版软件，采用平均矢量法进行模式识别。根据匹配结果计算各批次指纹图谱相似度均＞0.92，匹配确定其中8 个共有峰，指认其中4号峰、5号峰、6号峰、8号峰分别为升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷。

本文在标准汤剂研究的基础上，结合HPLC 指纹图谱与化学计量学方法，提供了中药饮片标准汤剂整体研究的新思路，通过CA 阐明不同产地防风饮片标准汤剂的质量概貌差异性，其结果表明防风样品与产地间存在一定的关联性。PCA 可以在尽可能保持原有数据信息的前提下，进行降维简化，通过PCA 分析降维处理后提取的2 个主成分，在反映不同来源样品与8 个共有成分的关系中起主导作用，可以代表防风标准汤剂中8 个共有峰的主要信息。PLS-DA 可以表明影响样品差异性的主要色谱峰，结合变量重要性投影法筛选出具有统计学意义的差异标志物，影响程度依次为峰3 ＞ 峰6 ＞ 峰4 ＞ 峰5。

目前，防风质量研究的定量分析主要集中在升麻素苷，5-O-甲基维斯阿米醇苷，但本研究表明升麻素、亥茅酚苷在指纹图谱上具有显著的特征性，并且人源肠Caco-2 细胞单层吸收模型[19]研究显示，升麻苷和亥茅酚苷具有中等程度的吸收性，表明它们可以通过进入血液循环发挥生物学活性。本研究对防风饮片标准汤剂中的4 种成分进行定量分析，其转移率依次为升麻素苷52.53%-88.03%、升麻素48.83%-82.85%、5-O-甲基维斯阿米醇苷41.90%-80.45%、亥茅酚苷37.69%-84.49%。在三个产地中，河北安国和河南安阳所产药材批次间稳定性较好，各批次药材含量无显著差别，其成分转移率较稳定，而内蒙赤峰所产药材批次间含量差异大，含量低的药材其成分转移率波动较大，特征成分转移率可以作为制备工艺的标尺，用于评价不同厂家生产工艺对中药制剂的影响。防风标准汤剂中除4 种主要成分外，仍有一些未知成分，其可能在临床疗效的过程中起着作用，本研究以膏率的形式表达了其他多种未知成分的提取率。防风标准汤剂的pH 结果可以作为样品稳定性考察的指标。

本研究制备得到的15 批防风饮片标准汤剂整体均一性良好，质量稳定，有助于标准化防风饮片的不同临床用药形式，解决因生产工艺、制备方法不同而造成的质量差异问题，保障药物临床疗效的一致性。本研究建立的HPLC色谱条件，既可以同时定量测定4种特征成分，也可以用作评价防风饮片标准汤剂质量标准的特征图谱，从定量和定性两个方面保障其质量稳定，可以有效实现防风的整体质量控制，为防风配方颗粒及相关经典名方的研究提供有益参考。