小承气汤“成分-靶点-通路”的网络药理学研究＊

宋晓彤 ，季旭明 ，于华芸 ，田 升 ，孙美灵 ，赵 月 ，吴智春 ＊＊

（1. 山东中医药大学中医学院 济南 250355；2. 浙江中医药大学基础医学院 杭州 310053；3. 山东省中医经典名方协同创新中心 济南 250355）

小承气汤出自《伤寒论》：“阳明病，脉迟……若腹大满不通者，可与小承气汤，微和胃气，勿令至大泄下”，由大黄四两、厚朴二两、枳实三枚组成，具有轻下热结之功效，用于治疗阳明腑实证。现代医家临床扩展用于治疗手术后肠梗阻[1,2]和胃肠动力恢复[3-5]、便秘[6-8]等胃肠动力障碍性疾病，具有较好临床疗效。中医经典名方具有整体理论、多组分、多靶点、多途径的特点，对于复杂疾病的治疗提供了广阔的前景，但本方主要活性成分、靶点仍不清楚，且缺乏整体分析其药理作用机制的研究。本研究基于网络药理学策略，系统研究小承气汤主要药效成分、作用靶标、相关通路，阐释“药物-靶点-通路”之间的相互作用，以期系统、全面阐释其物质基础及作用机制。

1 材料与方法

1.1 小承气汤化学成分收集及筛选

利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以及中药综合 数 据 库（TCMID，http://119.3.41.228: 8000/tcmid/search/），分别以大黄、厚朴、枳实为关键词，检索其含有的化学成分。并依据口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug-likeness，DL）进行筛选，阈值分别设为：OB ＞ 25%，DL ＞ 0.18。

1.2 化学成分靶点预测及小承气汤成分-靶点网络构建

基 于 SwissTargetPrediction 数 据 库（http://www.swisstargetprediction.ch）以及 STITCH 数据库（http://stitch.embl.de），将可能性设置为Probability ≥ 0.7，提取上述筛选得到的化学成分的潜在作用靶点；应用Cytoscape3.6.1 软件构建小承气汤中药材-活性成分-靶点网络图。

1.3 蛋白互作网络构建与关键靶点筛选

利用 STRING 平台（https://string-db.org/）将提取的活性成分潜在靶点构建靶蛋白群互作网络（proteinprotein interaction network，PPI network），应 用Cytoscape3.6.1软件的“Network Analyzer”功能对PPI网络进行拓扑结构分析，计算网络整体的“节点度值分布（Node Degree Distribution）”和“ 介 数 中 心 性（Betweenness Centrality）”两个重要拓扑参数，以Degree 和 Betweenness 的均数为“卡值”，选取二者同时在卡值之上的靶点为“关键靶点”。

1.4 小承气汤关键靶点的基因功能和信号通路分析

利用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov）对小承气汤的关键靶点进行基因本体论GO（gene ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集，设置P值＜0.01。

1.5 靶点蛋白分子对接

利用 RSCB PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载肿瘤坏死因子α（TNF-α，PDB ID：2AZ5）的3D 结构PDB 格式文件，运用pymol 软件删除2AZ5 的水分子及原小分子配体，用AutoDock Tools 1.5.6 添加非极性氢与电荷后保存为pdbqt 格式。利用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载关键化合物的SDF 格式文件，Chem3D 软件进行能量最小化优化后保存为mol2 格式，AutoDock 处理分子环肽后保存为pdbqt 格式。以TNF-α作为受体，以关键活性成分作为配体，运用AutoDock Vina 1.1.2 进行分子对接，设置Grid box 大小为 6 nm × 6 nm × 6 nm，spacing value 0.375，grid centerx= -14.9、y= 70.0、z= 20.9，GA runs=100，population size=150，其他参数设置为默认值。选择能量最低的构象作为TNF-α与配体的最佳结合构象，保存为 PDB 格式然后用Pymol、DS Visualizer 分析活性成分与TNF-α的结合位点及氨基酸残基的相互作用力。

2 结果

2.1 小承气汤化学成分收集与筛选

通过TCMSP 与TCMID 数据库，结合生物利用度和类药性进行筛选共收集小承气汤中3 味中药共201个化学成分，其中大黄65 个成分，枳实48 个成分，厚朴89个成分，枳实和厚朴2个共有成分。

2.2 化学成分靶点预测及小承气汤成分-靶点网络构建

利用SwissTargetPrediction 数据库及STITCH 数据库对上述筛选得到的201 个化学成分进行靶点预测，有62 个成分能找到对应潜在靶点248 个，共计得到小承气汤562 个“成分-靶点”对应信息，其中大黄25 个成分，预测靶点235 个；厚朴13 个成分，预测靶点86个；枳实24个成分，预测靶点241个，提示这62个化学成分为小承气汤的活性成分。

以大黄、厚朴和枳实三味中药为中心节点，内圈62 个绿色节点代表62 个化学成分，外圈248 个紫色节点表示潜在靶点，构建小承气汤“中药材-活性成分-靶点”网络图（图1），展示了该方多成分、多靶点的作用特征。

2.3 蛋白互作与关键靶点分析

将预测的小承气汤潜在靶点蛋白进行PPI网络分析，发现PPI 网络有232 个节点蛋白互作，2519 条相互作用线（图2）。PPI 网络平均度值为21.72，平均介数为6.17 × 10-3，网络度值分布与介数中心性分布整体情况（图3、图4）。度值、介数均超过平均值的50 个靶蛋白（表1），处于PPI 网络中的关键位置，可能是小承气汤实现药理效应的关键靶点。

2.4 小承气汤关键靶点的基因功能分析

通过DAVID 数据库分析，获得小承气汤50 个关键靶点的GO 富集分析结果27 条。GO 功能注释分析显示，涉及神经元投射、轴突、膜筏等细胞成分（cellular component）条目5 条；涉及染色质结合、类固醇结合、血红素结合、转录激活子活性等分子功能（molecular function）条目6 条；涉及对肌肉伸展的反应、乳腺肺泡的发育、一氧化氮生物合成过程、RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控等生物过程（biological process）条目16条（图5）。

图1 小承气汤“中药材-活性成分-靶点”网络

2.5 小承气汤关键靶点的信号通路分析

通过DAVID 数据库分析，获得关键靶点的KEGG通路富集分析结果63 条（图6）。其中涉及TNF 信号通路、MAPK 信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt 信号通路、炎症性肠病、色氨酸代谢、VEGF 信号通路等与胃肠道有关的信号通路共8条。

2.6 靶点蛋白分子对接分析

当配体与受体结合越稳定，能量越低，作用就越强，因此选取小承气汤的5 个核心成分与TNF-α进行分子对接。芦荟大黄素（aloe-emodin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、儿茶素（(-)-catechin）、木犀草素（luteolin）、厚朴酚（magnolol）与TNF-α的对接结果良好（表2、图7）。

3 讨论

图2 小承气汤潜在靶蛋白PPI网络

图3 度值分布图

小承气汤始见于张仲景《伤寒论》，现今被收录于国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》，由大黄、厚朴、枳实3味中药组成，重用大黄为君以泻热通便，厚朴行气散满，枳实破气消痞，诸药合用功效在荡热攻实，主治伤寒阳明腑实证，临床应用广泛。现代研究多涉及成分分析、药理作用和临床应用、历史沿革等[9]，但物质基础、作用靶点和作用机制不清，本研究以网络药理学为切入点，应用TCMSP、TCMID、 SwissTargetPrediciton、 STITCH、 STRING、DAVID 等数据库，分析小承气汤的有效活性成分及其作用靶点和作用途径。

图4 介数中心性图

表1 小承气汤关键靶点的拓扑参数

图5 小承气汤关键靶点GO基因功能分析

阳明腑实证为小承气汤主证，是指阳明经邪热不解，由经入腑，或热自内发，与肠中糟粕互结，堵塞肠道所表现出的，以“痞、满、燥、实”为特点的临床证候。研究显示其本质为胃肠功能失调而导致的全身炎症反 应 综 合 征[10]。 应 用 TCMSP、TCMID、STITCH 和SwissTargetPrediction 数据库筛选出64 个有效活性成分，其中大黄25 个成分主要是蒽醌衍生物；厚朴13 个成分，主要是桉树脑、厚朴酚、和厚朴酚等酚类成分；枳实24个成分，主要为黄酮类成分，如木犀草素、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黄酮、异橙黄酮等。研究显示大黄主要成分游离蒽醌衍生物（大黄酸、大黄素、芦荟大黄素和大黄酚等）、厚朴核心成分桉树脑和厚朴酚、枳实成分川陈皮素和黄酮类（木犀草素、甜橙黄酮）等可通过抑制炎性因子释放、下调NF-κB 通路、抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA 表达、抑制NALP3 炎症复合体的表达等多条途径发挥抗炎特性[11-20]；此外大黄的核心成分β-谷甾醇具有类糖皮质激素抗炎作用[21]，大黄成分结合蒽醌衍生物番泻苷B、掌叶二蒽酮、枳实成分新橙皮苷可调节胃肠运动[22,23]，发挥泻下作用；尤其是桉树脑和川陈皮素为胰腺炎、结肠损伤和慢性结肠炎等胃肠疾病的潜在新药[16,18]。因此，推测小承气汤的治疗作用主要是上述活性成分通过调节炎症反应和胃肠功能实现的。

基于预测靶点，以STRING 平台构建PPI，依据拓扑参数筛选出关键靶点50 个。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是位于细胞膜表面的酪氨酸激酶受体，促进中性粒细胞黏附于血管内皮细胞并向炎性部位趋化[24-26]，减少白细胞凋亡，并影响其功能。白细胞趋化的作用与肠黏膜屏障破坏有关，并且白细胞黏附后又会导致结肠组织破坏，造成恶性循环[25]。肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）是炎症趋化因子和激活因子，过量的TNF-α能够导致细胞破坏，释放大量的炎症介质，增强炎症局部淋巴细胞浸润和增殖，加重黏膜炎症反应[27]。基质金属蛋白酶 9（Matrix metalloproteinase 9，MMP9）作用于细胞外基质，通过激活P53 抑制细胞生长和促进细胞凋亡从而造成结肠组织损伤[28]。前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2，也称为COX-2）可催化花生四烯酸通过一系列反应生成前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）[29]。PGE2 是炎症反应的主要效应分子，可通过调节免疫细胞的分化或增加相关细胞因子的表达起到促炎作用，从而加剧炎症反应[30]。由此推测，小承气汤通过影响上述相关蛋白调节炎症反应，改善胃肠功能。

图6 KEGG信号通路富集图

表2 核心成分与TNF-α的结合能

图7 小承气汤部分核心成分与TNF-α分子对接图

研究还发现小承气汤作用关键靶点中存在参与神经递质转运、神经递质代谢、神经递质受体和神经元迁移相关的MAOA、MAOB、CASP3 和SLC6A4 等，这些基因编码的蛋白与多种精神性疾病相关[31-33]，可能是小承气汤治疗阳明腑实证之谵语烦热的作用靶点。

GO 分析显示，除涉及细胞对白介素1 的反应、细胞对脂多糖的反应、脂多糖介导的信号通路以及一氧化氮生物合成过程的正反馈等炎性介质代谢相关的生物过程，还涉及细胞周期调节、细胞信号转导等生物过程，提示小承气汤除了调节炎症反应、改善胃肠功能外，可能与肿瘤信号、细胞外基质代谢等有一定关系。

KEGG 富集结果显示，关键靶点的KEGG 通路包括与肠道疾病相关的TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll 样受体信号通路、HIF-1 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、炎症性肠病、色氨酸代谢、VEGF 信号通路。色氨酸与肠道黏膜的免疫活动密切相关，是评价炎症性肠病活动度的炎性标志物[34]。炎症性肠病时可导致色氨酸的消耗以及其代谢产物犬尿氨酸的积累，色氨酸消耗可诱导淋巴细胞生长停滞或抑制其分化，而犬尿氨酸积累则可抑制淋巴细胞分化[35]。在炎症性肠病中TNF 可诱导上皮细胞凋亡和炎症反应的发生[36]。MAPK在自身免疫和与炎症相关的疾病中起着重要作用[37]，MAPKs 需要通过三种细胞外信号调节蛋白激酶（p38，ERK1/2，JNK MAPKs）中的任何一种的磷酸化来激活，随后信号从细胞表面传导至细胞核。研究表明，MAPK 可以调节促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）的水平并上调促炎细胞的表达[38]。Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）信号通路是重要的炎症通路之一，其下游炎症信号级联反应加重疾病的发展，TLR2 和TLR4介导的炎症反应与炎症性肠病、自身免疫性疾病等多种免疫相关疾病密切相关[39]。缺氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）与炎性肠病密切相关，在胃肠道中，HIF-1 调节的基因产物，例如血管内皮生长因子、肠三叶因子、CD73 在肠道炎症动物模型起到保护作用[40]。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是内皮细胞的有效激活剂，并且是炎症性肠病发育过程中诱导血管生成的关键因素[41]，结肠内皮细胞中VEGFA 通过上调CAM并诱导中性粒细胞和T细胞的黏附而触发炎症。

肠道炎症以及屏障功能损伤是阳明腑实证的病理基础[42]，因此推测影响TNF 信号通路、MAPK 信号通路、Toll 样受体信号通路、HIF-1 信号通路、PI3K-Akt信号通路、炎症性肠病、色氨酸代谢、VEGF 信号通路是小承气汤调节肠道屏障功能，治疗阳明腑实证的作用途径。

此外，根据小承气汤关键靶点的KEGG分析，结果还涉及P53 信号通路、膀胱癌通路、大肠癌通路、癌症中的转录失调等癌症相关通路，但目前并没有相关文献报道，这可为经方小承气汤临床新用、新药研发提供一定思路。