FOXL2基因检测对卵巢成年型粒层细胞瘤诊断与鉴别诊断的价值

(1 中国人民解放军总医院第一医学中心病理科，北京 100853；2 航空总医院病理科)

卵巢粒层细胞瘤(GCT)是一种较常见的卵巢性索-间质瘤，发病率约占卵巢恶性肿瘤的2%～5%[1]。根据2014年WHO发布的《WHO女性生殖器官肿瘤分类》，卵巢GCT被分为成年型GCT(AGCT)以及幼年型GCT(JGCT)两类，其中以AGCT最为多见，约占95%以上。AGCT的发病机制仍不清楚[2-3]，特别是与部分卵巢卵泡膜-纤维瘤的鉴别诊断比较困难，是目前临床病理学诊断的难点之一。目前研究发现，翼状螺旋/叉头转录因子2 (FOXL2)通过转录调控作用调节靶基因转录及蛋白的表达，参与GCT的发生、发展过程[4-6]，FOXL2基因突变成为AGCT研究的重点方向。本研究通过比较AGCT和卵泡膜-纤维瘤的FOXL2基因突变情况，为两种肿瘤的诊断及鉴别诊断提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料来源

收集2012年1月—2018年12月中国人民解放军总医院第一医学中心及航空总医院病理科同期诊断为卵巢AGCT及卵泡膜-纤维瘤患者的标本各26例。AGCT患者(研究组)年龄28～76岁，平均52.7岁；主要症状为月经紊乱及绝经后阴道不规则流血，其次为腹痛或盆腔包块。其中7例为复发转移病例，已转移至盆腔、肝脏、肺、直肠等部位。卵泡膜-纤维瘤患者(对照组)年龄27～75岁，平均46.6岁；5例患者因腹部膨大、下腹痛、不规则阴道流血就诊，其余均因体检时超声检查发现卵巢占位而进行手术。

1.2 组织形态学观察

所有标本均经3.7%中性甲醛溶液固定，规范取材后转移至脱水机中脱水，然后透明、浸蜡、石蜡包埋，4 μm厚切片，苏木精-伊红(HE)染色后于显微镜下观察。

1.3 免疫组织化学检测

免疫组织化学检测采用EnVision二步法。石蜡组织样本4 μm厚切片，经二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水，以体积分数0.03过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，采用pH 7.0 EDTA缓冲液高压热修复抗原2 min。所用一抗包括CD99、抑制素(Inhi-bin-a)、钙网膜蛋白(Calretinin)、波形蛋白(Vimentin)、CD56等，二抗为PV-6000通用型试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，设立阴性及阳性对照，DAB显色，苏木精复染。

1.4 基因组DNA制备及基因测序

每个石蜡包埋标本均切取8～10个5 μm厚的石蜡卷，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(德国凯捷公司)提取基因组DNA。采用PCR方法扩增FOXL2基因的1号外显子，针对其突变的PCR上游引物序列为：5′-CCAGTACATCATCGCGAAG-TTCCCG-3′，下游引物序列5′-CTCCGGCCCCGA-AGAGCC-3′，扩增产物长度为269 bp。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，总共35个循环；末次循环72 ℃延伸10 min。收集PCR产物4 ℃下保存。扩增产物于20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，确定特异性扩增产物，最后对DNA产物纯化回收并进行Sanger测序(北京擎科生物科技有限公司)，测序仪型号3730XL。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病理形态学及免疫组化检查结果

镜下AGCT细胞生长方式多样，常见为弥漫型、条索状、缎带状和岛状结构，可见粒层细胞围绕小腔隙，形成微滤泡结构(Call-Exner小体)，腔内见嗜酸性分泌物；肿瘤细胞界限不清，胞浆稀少，细胞核圆形、卵圆形，可见核沟(图1A)。对照组镜下肿瘤细胞呈编织状、旋涡状排列，细胞以肥胖的短梭形细胞为主，胞核呈卵圆形，胞浆呈空泡状，富含脂质(图1B)。免疫组织化学染色结果显示，Vimentin、Inhibin-a、Calretinin、CD56及CD99在AGCT中阳性表达率分别为100%(25/25)、88.0%(22/25)、92.8%(13/14)、62.5%(10/16)、40.0%(6/15)；在对照组中的阳性表达率分别为100%(24/24)、76.9%(20/26)、73.1%(19/26)、0(0/11)、0(0/10)，其中两组Inhibin-a、Calretinin阳性表达率比较差异均无显著性(P>0.05)。

2.2 基因测序结果

测序结果显示，26例AGCT患者中19例检测到FOXL2 c.C→ G杂合性突变(图2A)，突变率为73.1%，对照组26例均未检测到该基因突变(图2B)，两者比较差异有统计学意义(χ2=8.089，P<0.05)。检测FOXL2突变诊断AGCT的灵敏度为73.1%，特异度为100%。

3 讨 论

AGCT是临床常见的一种具有内分泌功能的卵巢肿瘤，大多分泌雌激素，偶尔也会分泌雄激素，从而影响卵巢功能。其临床表现缺乏特异性，主要表现为阴道不规则流血、月经紊乱以及腹部包块。AGCT呈低度恶性，预后通常较好，5年生存率可达90%以上，但也有晚期复发情况，其复发时间个体差异较大，文献报道约2～37年[7-9]。如果肿瘤出现复发、自发破裂、盆腔内蔓延或肿瘤累及卵巢外的组织器官等情况时均提示预后不良。

A：AGCT，B：卵泡膜-纤维瘤，HE染色，200倍

A：AGCT中FOXL2c.C→G杂合性突变(箭头所示)；B：卵泡膜-纤维瘤中FOXL2野生型序列
图2 两种肿瘤中FOXL2基因突变情况

目前AGCT诊断主要依据的是其镜下病理学特征，不同性索-间质肿瘤间可能存在重叠的组织形态[10]，因此鉴别诊断有很大挑战性，尤其是对于复发转移病灶。AGCT属于低度恶性肿瘤，有远期复发的临床特征，而卵泡膜-纤维瘤是最常见的原发性卵巢实性肿瘤，绝大多数为良性，但两者常混合存在而且形态学有部分交叉，两者鉴别常常是临床病理工作的难点，尤其是弥漫型AGCT与富于细胞的卵泡膜瘤，肿瘤细胞均较密集，细胞呈圆形或卵圆形，光镜下不易分辨。网织纤维染色可能有所帮助，卵泡膜-纤维瘤显示网织纤维包绕着每个瘤细胞，而AGCT则呈巢状，网织纤维包绕团状瘤细胞[11]，但由于技术因素，如试剂的选择或操作不当，常常导致网状纤维染色不佳以致结果无法判读。

免疫组织化学染色结果显示，Inhibin-a、Calretinin、CD99、CD56等对AGCT诊断的灵敏度和特异度并不高[12]，虽然有助于确定这些肿瘤的细胞谱系，但不能区分不同肿瘤的类型。正如本组病例所示，性索-间质标志物Inhibin-a、Calretinin在两组病例中均有较高的表达，而Vimentin、CD99、CD56缺乏特异性，在多种肿瘤中均有表达，Vimentin在所有的间叶性肿瘤均表达，CD99、CD56在神经内分泌肿瘤、淋巴瘤中均表达。

FOXL2属于FOXL超家族成员，存在于卵巢、子宫内膜、垂体和发育的眼睑中，FOXL2是首个确定的维持卵巢正常功能的常染色体基因，是哺乳动物卵巢发育的最早标记物，具有维持人类卵巢功能作用，被认为是脊椎动物卵巢分化性别二态性标志物[13-14]。FOXL2基因可调节靶基因转录及其蛋白质表达，卵巢粒层细胞在增殖分化、卵巢发育及功能维持方面发挥着重要作用[15-16]。研究发现FOXL2是AGCT相对敏感并且具有较高特异度的诊断指标[17-18]，这一检测或许有助于病理医师更准确地对该病进行诊断。本研究探讨了26例AGCT患者的临床病理特征及FOXL2基因突变情况。目前，国外文献报道的AGCT患者中FOXL2c．402C→G杂合性突变率多在90%以上[19-21]。相比而言，本组资料中AGCT的突变率较低，为73.1%，可能因为样本量相对较少，存在部分偏差，因此尚需开展大样本资料做进一步探讨。本组26例卵泡膜-纤维瘤均未见该基因突变，与文献报道结果一致。进一步证明了FOXL2基因检测具有较高的特异度和灵敏度，对AGCT诊断及鉴别诊断具有较大的价值。多项研究表明，单一体细胞FOXL2突变几乎只发生在AGCT，而卵巢的上皮性肿瘤和其他性索-间质肿瘤(除个别支持-间质细胞瘤之外)均未发现该基因突变[22-26]。JAMIESON等[21]的研究结果显示，56例AGCT有52例(93%)携带FOXL2突变，4例为野生型，对其进行形态学再评价，发现这4例为误诊病例，不是AGCT。FASHEDEMI等[27]报道一组向高级别转化的AGCT患者，肿瘤部分区域显示了高级别肿瘤成分，检测出FOXL2基因突变，可以断定为AGCT向高级别转化，而不是混合其他类型高级别肿瘤的成分。还有研究显示随着临床分期的增高，AGCT组织中FOXL2基因的表达水平也升高，提示FOXL2在AGCT复发转移过程中也具有重要的意义[28-30]。

综上，卵巢AGCT依靠组织学及免疫组织化学检测结果进行诊断有一定的局限性，FOXL2基因突变在AGCT诊断及鉴别诊断中具有很高的价值，推荐辅助基因突变检测，以期提高AGCT病理诊断的准确性，为临床治疗该病提供可靠依据。