二甲双胍逆转低氧诱导的胰腺癌细胞铁死亡抵抗及潜在的作用机制

蔡晓杰， 王鸣， 高洁， 姜伟， 宋廉，张礼荣， 龚爱华， 朱海涛， 王冬青

(1. 江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013； 2. 江苏大学附属医院影像科， 江苏 镇江 212001)

胰腺癌已经成为仅次于肺癌的第二大癌症致死肿瘤[1]，且导致胰腺癌恶性程度极高的主要原因是化疗抵抗，而肿瘤微环境在胰腺癌治疗抵抗中发挥重要的作用。低氧是胰腺癌微环境最重要的特点之一[2]。低氧及其诱导的低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)参与多种肿瘤靶基因的转录调控，进而影响肿瘤细胞的能量代谢、增殖和凋亡，是导致放化疗诱导细胞死亡的最重要抵抗因素[3-4]。因此，有效的逆转低氧在肿瘤细胞死亡中的作用具有重要的意义。

铁死亡是一种新型死亡模式，其本质是细胞内脂质氧化物的代谢障碍，进而在铁离子的催化下产生大量脂质过氧化物，消耗抗氧化物，破坏细胞内氧化还原平衡，触发细胞死亡[5]。已有研究表明铁死亡诱导剂联合吉西他滨可有效抑制胰腺癌的增殖，促进细胞死亡[6]，但是这一联合效应却仍可以被低氧及其诱导的HIF-1α所缓解[7]。二甲双胍是调节细胞糖代谢的传统药物， 其可通过腺苷酸活化蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白(AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin，AMPK-mTOR)通路调控HIF-1α的表达[8]，同时也有研究提示雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)途径抑制剂雷帕霉素能够促进肿瘤细胞铁死亡[9]。因此，本研究拟探讨二甲双胍能否通过抑制HIF-1α进而逆转低氧引起的肿瘤细胞铁死亡抵抗效应，为胰腺癌的化疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

人胰腺癌Patu8988细胞株 (中国科学院上海细胞研究所)；DMEM高糖培养基，PBS(美国Hyclone公司)；澳洲胎牛血清(美国Gibco公司)；二甲双胍、Erastin、铁死亡抑制剂ferrostatin-1、凋亡抑制剂ZVAD-FMK、坏死抑制剂necrosulfonamide(美国MedChemExpress公司)；兔抗人多克隆抗体HIF-1α(美国Abcam公司)；兔抗人单克隆抗体β-微管蛋白，兔抗人多克隆抗体p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)(美国Cell 公司)；羊抗兔二抗(美国Santa Cruz公司)；6孔细胞培养板、96孔细胞培养板(美国Corning公司)；CCK8试剂盒(北京智杰方远科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 常氧培养：Patu8988细胞培养在含10 %胎牛血清的高糖DMEM中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中。低氧培养：将细胞置于密封的低氧培养盒中，向低氧培养盒里充入低氧混合气体(1% O2，5% CO2，94% N2，购自南大恒通气体厂)，持续充入10 min然后将低氧培养盒转移到37 ℃培养箱中培养。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活性 取对数生长期Patu8988细胞接种于96孔板，每孔5 000个细胞，每组设3个复孔；次日细胞贴壁后，经或不经药物处理，分别置于常氧和低氧培养条件下；待达到作用时间，配置CCK-8反应溶液(90 μL无血清培养基+10 μL CCK-8试剂)；取出96孔板，每孔加入100 μL反应溶液，同时设立空白组(只含DMEM)进行校正；分别置于不同培养条件培养2 h；用酶标仪测定450 nm波长处各孔光密度(D)值。每组实验独立重复3次。计算细胞活性=实验组-空白组/对照组-空白组。

1.2.2.1 常氧和低氧培养不同时间细胞的活性 将细胞接种于96孔板后置于常氧和低氧培养条件，分别在0、12、24、48 h时间点取出，加入CCK-8检测各孔细胞活性。

1.2.2.2 经不同浓度的Erastin处理不同时间后细胞的活性 用培养基将Erastin浓度稀释为0、2.5、5、10、20 μmol/L，分别取100 μL与细胞共孵育；置于常氧和低氧培养条件，分别在0、12、24、48 h时间点取出，加入CCK-8检测各孔细胞活性。

1.2.2.3 经不同药物分组处理后细胞的活性 细胞与各组药物(对照组、10 μmol/L Erastin组、40 mmol/L二甲双胍组、10 μmol/L Erastin+40 mmol/L二甲双胍组、10 μmol/L Erastin+40 mmol/L二甲双胍+1 μmol/L Ferrostatin组、10 μmol/L Erastin+40 mmol/L二甲双胍+1 μmol/L ZVAD-FMK组、Erastin+40 mmol/L二甲双胍+1 μmol/L necrosulfonamide组)在低氧条件下共孵育24 h后取出，加入CCK-8检测各孔细胞活性。

1.2.2.4 经不同浓度二甲双胍处理后细胞的活性 用培养基将二甲双胍浓度稀释为0、20、40、80 mmol/L，分别取100 μL与细胞在低氧条件下共孵育24 h后取出，加入CCK-8检测各孔细胞活性。

1.2.3 蛋白质印迹法检测细胞相关蛋白的表达 收集Patu8988细胞，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，100 ℃煮沸5 min；离心机12 000×g离心5 min，所得上清液即为蛋白样品。以每个泳道20 μL蛋白样品上样，行10 % SDS-PAGE；将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭1 h；加入一抗，4 ℃孵育过夜；次日TBST洗膜3次，每次10 min；二抗37 ℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL发光试剂显影，在凝胶成像系统上拍照并分析。一抗分别为兔抗人多克隆抗体HIF-1α，兔抗人多克隆抗体GPX4，兔抗人多克隆抗体p-AMPK， 兔抗人多克隆抗体AMPK，兔抗人多克隆抗体p-mTOR，兔抗人多克隆抗体mTOR，内参为兔抗人单克隆抗体β微管蛋白(均为1 ∶1 000)；二抗为羊抗兔二抗(1 ∶10 000)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 低氧抑制胰腺癌细胞活性

与常氧组相比，低氧组Patu8988细胞活性降低，且低氧培养24、48 h细胞活性明显低于常氧组(t=2.83、13.16，P<0.05)。见图1。由此说明低氧能够抑制胰腺癌细胞活性。

a:P<0.05,与常氧组比较

2.2 低氧使得胰腺癌细胞发生铁死亡抵抗

与对照组相比，不同浓度的铁死亡诱导剂Erastin处理24 h后，常氧或低氧培养的Patu8988细胞的细胞活性均减低。在同一Erastin浓度处理条件下，与常氧组相比，低氧组Patu8988细胞活性高于常氧组。且当Erastin浓度为10 μmol/L时，两组间细胞活性存在最显著的差异(t=3.51，P<0.05)。故选择10 μmol/L 作为Erastin后续处理浓度。见图2。

a：P<0.05，与常氧组比较

由图3可见，与对照组相比，Erastin分别处理常氧和低氧培养条件下的Patu8988细胞 12、24和48 h，Patu8988细胞的活性均减低。在同一培养时长条件下，与常氧组相比，低氧组细胞的细胞活性高于常氧组，且在24 h差异最大(t=2.46，P<0.05)。由图4可见，低氧条件下，Patu8988细胞中HIF-1α的蛋白表达水平呈一定的时间依赖性，在24 h时，蛋白表达水平最高(t=40.68，P<0.05)。由此可见，低氧条件下细胞HIF-1α表达变化与Erastin对细胞的活性变化存在一定的一致性。

a：P<0.05，与低氧组比较

a：P<0.05，与低氧0 h比较

2.3 二甲双胍增敏低氧条件下Erastin诱导的铁死亡效应

与对照组相比，低氧条件下Erastin，二甲双胍均可抑制Patu8988细胞的活性。与单独Erastin组相比，Erastin+二甲双胍抑制作用更加显著(t=58.45，P<0.01)。与联合用药组相比，外加铁死亡特异性挽救剂Ferrostatin后，细胞明显恢复活性(t=10.77，P<0.05)，而外加凋亡抑制剂ZVAD-FMK组和necrosulfonamide组与联合组比，差异均无统计学意义。由此说明，联合用药是通过增强铁死亡效应来进一步抑制细胞活性。见图5。蛋白印迹显示，单独使用Erastin处理后GPX4蛋白水平降低，Erastin联合二甲双胍处理后与单独Erastin组相比进一步降低了GPX4蛋白水平(t=3.05，P<0.05)，同时抑制了HIF-1α的表达(t=10.95，P<0.05)。见图6。进一步说明二甲双胍可以逆转低氧诱导的Patu8988细胞对铁死亡诱导剂Erastin的抵抗。

a：P<0.01，与未经药物处理组比较；b：P<0.05，与Erastin+二甲双胍组比较

图5各组药物作用24 h后对低氧下细胞活性的影响

a：P<0.01，与未经药物处理组比较； b: P<0.05，与Erastin组比较

2.4 低氧条件下二甲双胍阻断HIF-1α的积聚

在低氧条件下使用不同浓度的二甲双胍作用于细胞24 h，图7可见，随二甲双胍浓度递增，细胞活性呈浓度依赖性降低。蛋白印迹结果显示，二甲双胍浓度递增促进了AMPK的磷酸化，同时抑制其下游的重要信号分子mTOR的磷酸化，进而显著降低了HIF-1α蛋白水平，见图8。从而验证了AMPK-mTOR/HIF-1α信号通路在二甲双胍抑制胰腺癌中发挥重要作用。

a：P<0.05，与0 mmol/L二甲双胍处理组比较

a：P<0.05；b：P<0.01，与0 mmol/L二甲双胍处理组比较

3 讨论

铁死亡是一种由铁离子催化、多不饱和脂肪酸的过度氧化而诱导的一种新型细胞程序性死亡模式[5]。脂质过氧化形成导致活性氧过度积累是诱发细胞铁死亡的关键因素[9]。GPX4是铁死亡发生的重要指标，一旦失效，会造成膜脂上活性氧自由基的积累，引发铁死亡。铁死亡概念的提出为多种实体瘤的治疗提出了新的理念[10-12]。研究发现，青蒿琥酯可诱导Kras突变的胰腺癌细胞铁死亡[13]；联合荜拨明碱、植物生长调节剂CN-A 和柳氮磺胺吡啶可以有效地抑制胰腺癌的生长，主要是通过诱导铁死亡作用[14]。本研究发现，铁死亡诱导剂Erastin可以诱导人胰腺癌Patu8988细胞铁死亡，这与以往的报道一致[15]。虽然针对铁死亡的研究有效地改善了肿瘤的抑制效应，但是部分肿瘤仍具有铁死亡抵抗的特征。有研究发现，肿瘤细胞可通过Prominin2 MVB外显子铁蛋白途径抵抗铁死亡[16]，也可以通过cadherin-NF2-Hippo-YAP通路负向调控铁死亡[17]。尽管针对铁死亡的抵抗机制做了深入的研究，但是绝大多数的研究都是基于细胞自身的因素。而微环境因素对肿瘤细胞铁死亡的作用机制还不是十分明确。本研究结果提示低氧可以促进胰腺癌细胞的铁死亡抵抗。

低氧是胰腺癌肿瘤微环境的最重要特征之一。低氧通过激活HIF-1α调控多种信号分子，进而影响肿瘤的放疗、化疗抵抗、转移及肿瘤血管生成等生物学行为[3-4,18]。本研究发现，低氧条件下，人胰腺癌细胞对铁死亡诱导剂Erastin抵抗性增强，呈一定的时间依赖性。且抵抗的时间依赖性与HIF-1α表达变化趋势一致，提示HIF-1α在低氧胰腺癌中起着负向调控铁死亡的作用。我们推测：细胞内积累的HIF-1α抑制低氧引起的活性氧的产生，进而抑制活性氧积累引起的铁死亡。这一效应仍需要更多的实验数据来证实。

二甲双胍抗肿瘤得到了越来越多的关注。但是当前二甲双胍使用浓度远大于临床治疗浓度[19]，因此临床转化存在风险。如果能够将二甲双胍和其他抑癌药物联合使用，可以有效地降低二甲双胍的使用浓度。二甲双胍抗肿瘤机制之一是通过激活AMPK抑制mTOR从而抑制上述HIF-1α的表达[20]。我们的研究结果证实，低氧条件下在Patu8988细胞中随二甲双胍浓度递增AMPK激活，mTOR磷酸化受到抑制，HIF-1α表达也随之下调。同时，联用二甲双胍和铁死亡诱导剂Erastin与单独用Erastin组比，有效地减少了HIF-1α的聚集，降低了GPX4的表达，增强了铁死亡效应。低氧条件下二甲双胍逆转铁死亡抵抗的示意图概述见图9。

图9 低氧下二甲双胍逆转铁死亡抵抗原理示意图

然而在上述过程中二甲双胍对HIF-1α的抑制是否主要由AMPK-mTOR途径调控还有待于进一步研究。 综上所述，二甲双胍可以通过AMPK-mTOR/HIF-1α信号通路减弱低氧引起的胰腺癌细胞对铁死亡抵抗。