二甲双胍抑制赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1介导的卵巢癌细胞增殖和迁移

韩田田， 孟红霞， 赵康容， 孙爱琴， 杨万年， 邵根宝

(江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013)

二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线药物[1]。近来研究表明，二甲双胍具有抗癌、免疫调节和抗衰老作用[2]。有文献报道二甲双胍可以抑制卵巢癌细胞增殖和迁移[3]。然而，其具体机制仍未阐明。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)是第一个鉴定出的组蛋白去甲基化酶，其通过对单甲基化和二甲基化的组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4me1/2)去甲基化抑制基因转录[4]。LSD1在多种肿瘤中呈高表达，如卵巢癌[5]、肺癌[6]、乳腺癌[7]和胃癌[8]等，其过表达与患者生存率呈负相关[9]。临床已将LSD1确定为癌症治疗靶标[10]。关于抑制LSD1表达对于卵巢癌的靶向治疗影响尚不清楚。本研究拟通过免疫印迹检测二甲双胍抑制LSD1蛋白表达和PI3K/AKT通路蛋白表达，并进一步敲低LSD1，观察其在二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖和迁移中的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞和细胞培养

卵巢上皮癌HO8910和SKOV3细胞株为本实验室长期保存；多西环素诱导型稳定敲低LSD1的HO8910和SKOV3细胞株(HO8910-shLSD1和SKOV3-shLSD1)是用pLKO-Tet-puro慢病毒诱导型载体构建，参考文献[11]。HO8910和SKOV3细胞在含有10%胎牛血清的高糖DMEM中，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2 抗体和试剂

兔单克隆抗体LSD1、凋亡抑制蛋白(Survivin)、组蛋白H3、组蛋白H3第4位赖氨酸二甲基化(H3K4me2)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、E-钙黏蛋白、波形蛋白和锌指转录蛋白(Snail)均为美国Cell Signaling 公司产品；兔单克隆抗体β-微管蛋白(美国Bioworld公司)；兔单克隆抗体P21(美国Abcam公司)；HRP标记的羊抗兔抗体、总RNA抽提试剂盒(上海Sangon公司)；二甲双胍(北京索莱宝公司)；多西环素(美国Sigma-Aldrich公司)；5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(5-Ethyny1-2′-deoxyuridine，EdU)检测试剂盒(广东锐博公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；2×SYBR Green PCR预混液、反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；ECL显影试剂(上海碧云天公司)。

1.3 EdU染色法检测不同浓度二甲双胍处理后细胞的增殖能力

取HO8910和SKOV3两种卵巢癌细胞株，每种细胞以5×103个/孔密度接种于96孔板，按二甲双胍不同处理浓度(0、5、10和20 mmol/L)分为4组，每组设3个复孔。培养24 h后细胞贴壁，严格按照EdU检测试剂盒说明书对细胞进行染色，EdU绿色荧光代表正处于DNA复制期的细胞，DAPI荧光代表所有的活细胞。显微镜下观察并计数EdU阳性细胞数。细胞增殖率(%)=EdU阳性细胞数/所有活细胞×100%。实验重复3次。

1.4 EdU实验检测二甲双胍处理和敲低LSD1后卵巢癌细胞的增殖能力

取HO8910-shLSD1和SKOV3-shLSD1两种细胞株，每种细胞分为对照组、二甲双胍处理组和敲低LSD1组，分别予以PBS，10 mmol/L二甲双胍，100 ng/mL多西环素处理48 h。采用EdU实验检测细胞增殖能力。具体实验操作方法同“1.3”。实验重复3次。

1.5 迁移实验检测细胞迁移能力

取“1.3”和“1.4”分组细胞，制备成不含血清的细胞悬液，每个Transwell小室上室接种2×104个细胞，Transwell下室加入500 μL含血清的DMEM。在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h；用棉签擦拭膜表面未迁移的细胞；4%低聚甲醛固定30 min；室温下用0.1%结晶紫染色20 min。显微镜下随机选择5个视野细胞，拍照并计数。实验重复3次。

1.6 实时荧光定量PCR检测LSD1 mRNA表达水平

取“1.3”分组细胞，严格按照RNA抽提试剂盒说明书提取细胞RNA，并用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。然后以cDNA为模板进行PCR扩增。LSD1引物序列：上游，5′-CAAGTGTCAATTTGTTCGGG-3′；下游，5′-TTCTTTGGGCTGAGGTACTG-3′；GAPDH引物序列：上游，5′-GCAAATTCCATGGCACCGTC-3′，下游，5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′，以GAPDH为内参。PCR扩增条件： 95 ℃初始变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。基因的相对表达量用2-ΔΔCt值表示。实验重复3次。

1.7 免疫印迹检测LSD1、增殖相关蛋白、迁移相关蛋白及PI3K/AKT通路蛋白的表达

取“1.3”和“1.4”分组细胞，PBS洗2次，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液裂解细胞30 min；4℃行12 000×g离心15 min，上清液即为蛋白样品。将蛋白样品行10% SDS-PAGE，80 V电压30 min，110 V电压100 min；300 mA恒流130 min转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入一抗和β-微管蛋白于4℃摇床孵育过夜；次日TBST洗涤3遍，每次8 min；加入二抗室温反应1 h；ECL显影，用Image J软件定量，与内参β-微管蛋白比较。一抗LSD1、Survivin、P21、组蛋白H3、H3K4me2、E-钙黏蛋白、波形蛋白、Snail、PI3K、p-AKT、AKT稀释比均为1 ∶1 000、β-微管蛋白稀释比为1 ∶5 000；二抗稀释比为1 ∶5 000。实验重复3次。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖

EdU结果显示，与0 mmol/L组相比，卵巢癌HO8910细胞和SKOV3细胞5、10、20 mmol/L组细胞增殖率显著降低(P均<0.01)，二甲双胍处理组细胞增殖受到明显抑制，呈浓度依赖性。见图1。免疫印迹结果显示，与0 mmol/L组相比，HO8910和SKOV3细胞中10、20 mmol/L组Survivin 表达显著降低(P<0.01或P<0.05)，P21表达显著升高(P均<0.01)。见图2。

a：P<0.01，与0 mmol/L组比较

a：P<0.01，b：P<0.05，与0 mmol/L组比较

2.2 二甲双胍抑制卵巢癌细胞迁移

迁移实验结果显示，与0 mmol/L组相比，HO8910细胞和SKOV3细胞中5、10、20 mmol/L组细胞迁移数均显著减少(P均<0.01)，二甲双胍处理组细胞迁移受到明显抑制，呈浓度依赖。见图3。免疫印迹结果显示，HO8910细胞中，与0 mmol/L组相比，5、10、20 mmol/L组E-钙黏蛋白表达显著升高(P均<0.01)，波形蛋白和Snail表达显著降低(P均<0.01)。SKOV3细胞中，与0 mmol/L组相比，10、20 mmol/L组E-钙黏蛋白表达显著升高(P均<0.01)，波形蛋白和Snail表达显著降低(P均<0.01)。见图4。

a：P<0.01，与0 mmol/L组比较

a：P<0.01，与对照组比较

2.3 二甲双胍下调LSD1蛋白表达

免疫印迹结果显示，随着二甲双胍浓度升高，HO8910细胞和SKOV3细胞中5、10、20 mmol/L组LSD1蛋白表达水平较0 mmol/L组明显降低(P<0.05或P<0.01)，其底物H3K4me2蛋白表达水平明显升高(P均<0.01)。见图5。qRT-PCR结果显示，与0 mmol/L处理组相比，HO8910和SKOV3细胞中5、10、20 mmol/L处理组LSD1 mRNA表达水平无明显变化(P均>0.05)。见图6。

2.4 二甲双胍抑制PI3K/AKT信号通路

免疫印迹结果显示，随着二甲双胍浓度升高，HO8910和SKOV3细胞中5、10、20 mmol/L组p-AKT 和PI3K 蛋白表达均较0 mmol/L组明显降低(P均<0.01)。见图7。

a：P<0.05，b：P<0.01，与0 mmol/L组比较

图6 实时定量PCR检测不同浓度二甲双胍处理后各组细胞LSD1 mRNA水平

2.5 二甲双胍处理和敲低LSD1均抑制细胞增殖

EdU结果显示，HO8910-shLSD1细胞和SKOV3-shLSD1细胞中对照组细胞增殖率均显著高于二甲双胍处理组和敲低LSD1组(P均<0.01)。见图8。免疫印迹结果显示，与对照组相比，HO8910-shLSD1细胞和SKOV3-shLSD1细胞中二甲双胍处理组和敲低LSD1组Survivin表达显著降低(P均<0.01)，P21表达显著升高(P均<0.01)。见图9。

a：P<0.01，与0 mmol/L组比较

a：P<0.01，与对照组比较

a：P<0.01，与对照组比较

2.6 二甲双胍处理和敲低LSD1均抑制细胞迁移

迁移实验结果显示，HO8910-shLSD1细胞和SKOV3-shLSD1细胞中对照组细胞迁移数均显著高于二甲双胍处理组和敲低LSD1组(P均<0.01)。见图10。免疫印迹结果显示，与对照组相比，HO8910-shLSD1细胞和SKOV3-shLSD1细胞中二甲双胍处理组和敲低LSD1组E-钙黏蛋白表达显著升高(P均<0.01)，波形蛋白和Snail蛋白表达显著降低(P均<0.01)。见图11。

3 讨论

本研究采用HO8910和SKOV3两种卵巢癌细胞株，通过EdU实验和迁移实验证实二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖和迁移，PI3K/AKT/LSD1信号轴介导二甲双胍对卵巢癌细胞的增殖和迁移。

研究报道，卵巢癌患者经二甲双胍治疗可降低疾病死亡率和复发率[12]。也有研究发现，二甲双胍可改变卵巢癌细胞代谢并抑制肿瘤生长[13]。另有研究表明，Survivin表达降低、P21表达升高代表肿瘤细胞增殖能力降低，E-钙黏蛋白表达降低、波形蛋白和Snail表达升高代表肿瘤细胞迁移能力增强[8]。本研究结果显示二甲双胍对卵巢癌HO8910和SKOV3细胞增殖和迁移具有抑制作用，且呈浓度依赖性。用不同浓度二甲双胍处理HO8910和SKOV3细胞后，细胞增殖率明显降低，且Survivin表达显著升高，P21表达显著降低。与0 mmol/L相比，细胞在二甲双胍作用下迁移能力显著降低，且E-钙黏蛋白表达显著降低，波形蛋白和Snail表达显著升高。由此表明，二甲双胍可以抑制卵巢癌细胞增殖和迁移。

a：P<0.01，与对照组比较

a：P<0.01 ，与对照组比较

关于二甲双胍抗肿瘤作用的研究多集中于AMPK信号通路[14]。也有研究发现二甲双胍可通过PI3K/AKT信号通路影响细胞增殖[15]，但具体机制仍不清楚。研究发现，LSD1在卵巢癌细胞中呈高表达[16]，其可通过多种作用方式调控卵巢癌的发生发展[9]。本研究结果显示，HO8910和SKOV3细胞经不同浓度二甲双胍处理后，5、10、20 mmol/L组LSD1蛋白表达水平较对照组逐渐降低，且呈浓度依赖性，其底物H3K4me2蛋白表达水平逐渐升高。由此表明，二甲双胍可抑制卵巢癌细胞中LSD1蛋白表达以及LSD1去甲基化酶活性。我们之前的研究表明，LSD1受PI3K/AKT信号通路调控[16]。本研究结果显示，不同浓度二甲双胍处理细胞后，p-AKT和PI3K蛋白表达水平显著降低，且呈浓度依赖性。由此表明，二甲双胍可负调控PI3K/AKT信号通路，进而抑制LSD1蛋白表达及其去甲基化酶活性。

研究表明，过表达LSD1可促进卵巢癌细胞增殖[16]。另有研究发现，LSD1介导的表观遗传修饰促进卵巢癌细胞迁移和侵袭[17]。为进一步验证LSD1与二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的相关性，本实验采用诱导性稳定敲低LSD1的细胞株检测二甲双胍处理和敲低LSD1后细胞的增殖和迁移能力。根据上述结果，选择10 mmol/L二甲双胍作为实验浓度。结果显示，二甲双胍处理和敲低LSD1后，细胞增殖率均显著降低，且Survivin表达均显著降低，P21表达均显著升高。此外，E-钙黏蛋白表达均显著升高，波形蛋白和Snail表达均显著降低。由此表明，二甲双胍处理和敲低LSD1产生的作用相似，均显著抑制卵巢癌细胞增殖和迁移，提示LSD1可能是二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的靶标。

综上所述，二甲双胍在卵巢癌细胞中通过抑制PI3K/AKT信号通路及LSD1蛋白表达进而抑制卵巢癌细胞增殖和迁移。PI3K/AKT通路对LSD1的调控作用是否与表观遗传修饰有关仍要进一步研究。