正交试验设计法优选六高康颗粒水提工艺*

黄庆宝，黄诗莹，，陈剑平，张尚斌，，谢静静，张剑勇△

（1.广东省深圳市中医院·深圳市医院中药制剂研究重点实验室，广东 深圳518033；2.广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳518033）

痛风患者常合并有其他疾病，如高血压、糖尿病、高脂血症、肥胖等[1]。深圳市中医院张剑勇教授根据多年风湿病临证经验，在代谢综合征（MS）的基础上提出“痛风六高症”学说，临床表现为高尿酸血症（痛风）、高体质量（肥胖）、高血压（高血压病）、高血糖（糖尿病）、高血脂（高脂血症）等症。六高康方具有泄浊利湿、消积排毒、润肺健脾、补益肝肾、标本兼治的功效，治疗痛风疗效明确且可改善其他代谢指标[2-3]。但本方在使用前需先进行煎煮，使用和携带都不方便。颗粒剂具有载药量大、吸收快、稳定性好、服用和携带方便等优点[4]，可弥补汤剂的不足，故本研究拟将其开发成颗粒剂。查阅文献[5-6]，君药土茯苓中有效活性成分落新妇苷具有泄浊解毒、通利关节功效，与六高康方的治疗功效相符。此外，干膏率可反映其他成分的溶出程度[7-8]。故本研究中选择落新妇苷含量及干膏率作为评价指标，采用正交试验法对该方的水提过程中加水倍数、煎煮时间、煎煮次数等影响因素进行考察，优选出六高康方的水提工艺，为该院内制剂的提取工艺优化提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2030型高效液相色谱仪（日本岛津公司，SIL-20A自动进样器）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，250 W，40 kHz）；EP225SM-DR型电子分析天平（瑞士Pricisa公司，精度为十万分之一）；GZX-9140MBE型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）。

1.2 试剂

土茯苓、百合、葛根、金钱草、玉米须、益母草、灵芝、炒决明子、山楂、炒牛蒡子、山慈菇、钩藤、刺五加、郁金、菊花、柴胡、天麻、山茱萸，均购自深圳市华辉药业有限公司，批号分别为190213，190117，180911，190120，190210，181211，181225，181208，190112，181125，190118，181203，190118，190215，190115，181209，180211，经深圳市中医院张尚斌主任中药师鉴定为正品。落新妇苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111798-201504，纯度93.9%）；水为纯化水，冰醋酸为分析纯，甲醇为色谱纯（默克公司）。

2 方法与结果

2.1 落新妇苷含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Sepax Bio-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（B）-0.1%冰醋酸（A），梯度洗脱（0～20min时28%B，20.01～23 min时28%→90%B，23.01～24 min时90%A→28%B，24～31 min时28%B）；流速：1.0mL/min；检测波长：291nm；进样量：5μL；柱温：35℃。

2.1.2 溶液制备

样品溶液：取处方量饮片，每份221 g，按L9（34）正交试验法进行提取，趁热滤过，浓缩，放冷至室温，加水定容至500 mL，备用。

供试品溶液：精密量取样品溶液1 mL，加甲醇定容至20 mL，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

对照品溶液：取落新妇苷1.03 mg，精密称定，加甲醇溶液溶解并定容至5 mL，摇匀，即得。

阴性对照品溶液：称取缺土茯苓的处方量，按样品溶液提取方法制备样品溶液，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：取2.1.2项下对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各5 μL，按拟订色谱条件进样测定。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰，而阴性对照无干扰。详见图1。

图1 高效液相色谱图

标准曲线绘制：精密量取落新妇苷对照品溶液适量，加甲醇溶液逐级稀释，分别制得质量浓度为4.84，9.67，19.34，38.69，77.37，154.75 μg/mL的系列对照品溶液，分别量取5 mL，按拟订色谱条件进样测定，以落新妇苷峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=6 286.01X-14 572.7（r=0.999 4，n=6）。结果表明，落新妇苷质量浓度在4.84～154.75 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。同时，以峰面积为噪音3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10）的进样质量浓度分别测得检测限为0.12 μg/mL，定量限为0.34 μg/mL。

精密度试验：精密量取同一落新妇苷对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，计算落新妇苷峰面积。结果落新妇苷峰面积的RSD为0.87%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取样品溶液1 mL，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时按拟订色谱条件进样分析，计算峰面积。结果落新妇苷峰面积的RSD为1.01%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：精密量取样品溶液6份，每份1 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，计算峰面积。结果落新妇苷的平均质量浓度为54.0652μg/mL，RSD为1.55%（n=6），表明该方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取质量浓度为54.0652μg/mL的样品溶液1 mL，平行9份，分别加入低、中、高3组不同含量的落新妇苷对照品，加入量与落新妇苷含量比例分别为0.5∶1，1∶1，1.5∶1，每组3份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，测定峰面积，并计算回收率。结果见表1。

表1 落新妇苷加样回收试验结果（n=9）

2.2 干膏率测定

精密量取2.1.2项下水提溶液50.00 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，精密称定质量，计算出膏率。出膏率（%）=[（W×500）/50.00/221]×100%，其中常数221为处方药材总质量，W为50.00 mL浓缩液中固形物质量。

2.3 正交试验设计

因素与水平：查阅相关文献及单因素试验结果[7-8]，采用正交试验设计法，以样品溶液中落新妇苷含量和干膏率为评价指标，对影响提取工艺的加水倍数（因素A）、提取次数（因素B）、提取时间（因素C）进行优选，各因素水平表见表2。

表2 因素水平表

正交试验结果：按L9（34）正交试验表设计试验，采用加权评分法分析试验结果，设定落新妇苷的含量加权系数为0.6、干膏率的加权系数为0.4，综合评分值=（干膏率/干膏率最大值×0.4+落新妇苷含量/落新妇苷含量最大值×0.6）×100，结果见表3和表4。由表3直观分析可得，综合各因素影响水平为B＞C＞A，提取条件以A3B3C3为佳。为了验证直观分析结果，对试验数据进行了方差分析，方差分析结果表明，提取次数对水提工艺中干膏率和落新妇苷含量的影响有显著性差异。称取处方量饮片，对A1B3C1和A3B3C32个工艺进行比较验证试验。由见表5可见，两者正交试验方差分析结果差异不大。故从节省溶剂及节省时间考虑，确定最佳提取工艺为A1B3C1，即煎煮3次，每次加8倍量水，每次煎煮45 min。

表3 正交试验设计及试验结果

表4 方差分析结果

表5 优选提取工艺比较验证试验结果

2.4 验证试验

为验证所得组合工艺的可行性，进行了3批验证试验。取处方量，按优选工艺进行提取，测定干膏率及落新妇苷含量。结果见表6。可见，验证试验综合评分值的平均值为97.23，表明正交试验优选的条件稳定可行，可作为六高康颗粒的提取工艺。

表6 工艺验证试验结果（n=3）

3 讨论

本方由18味中药材组方，根据前期药理研究表明[9-14]，方中主要药效活性成分为生物碱类、黄酮类及多糖类，以水溶性成分为主，考虑到各成分溶解性能和临床疗效，故选择以水为溶剂煎煮提取。

传统中药复方组分复杂，研究采用多指标成分考察提取工艺[7-8]。臣药中天麻有效活性成分天麻素、对羟基苯甲醇，臣药钩藤中有效活性成分钩藤碱、异钩藤碱，佐药决明子中有效活性成分大黄酚、橙黄决明素，以上3种饮片中的有效活性成分含量较低，难以检测。同时对佐药葛根中有效活性成分葛根素进行测定，结果表明，与方中其他成分互相干扰，通过改变流速、调整流动相比例及更换不同流动相进行洗脱，结果在相同保留时间内存在干扰，分离度低，均无显著效果，不能选择以上4种饮片中的有效活性成分作为提取工艺的指标成分[15-19]。落新妇苷属黄酮苷类化合物，具有抗炎、免疫抑制、抑制排异反应、保肝护肾、抗氧化、镇痛、抗水肿、抗菌、抗糖尿病等多种药理活性，临床上可用于治疗痛风，其效果显著，且不良反应少[20]。试验发现，君药土茯苓中落新妇苷分离度好，紫外吸收强，出峰位置无干扰，保留时间相对适中，故最终选取落新妇苷含量作为水提工艺的评价指标。

参考文献[7-8]与单因素试验结果可见，加水倍数、提取时间、提取次数3个因素对该处方的提取效率影响较大。因方中多为全草类、根茎类饮片，饮片吸水较多，故设置加水倍数的参数较大。正交试验结果显示，优选的3个影响因素均为极值，但只有提取次数具有显著性。

综上所述，该方法操作简便，优选出的提取工艺稳定性好、可靠性强，可为六高康颗粒进一步开发成中药制剂提供重要参考。