黄芩苷预防和治疗牙周炎研究进展

李伶俐，李 潇

(1.暨南大学 口腔医学院，广东 广州 510632；2.中国人民解放军南部战区总医院，广东 广州 510010)

牙周炎是牙菌斑与宿主免疫反应相互作用后产生的炎症性疾病，炎症破坏牙周支持组织形成牙周袋，最终导致牙齿松动脱落。目前，对于牙周炎的经典治疗方法是机械性清除菌斑、牙石并控制其他局部刺激因素。但在复杂的牙根结构中存在器械无法达到的盲区，这些区域的细菌无法通过器械彻底去除。此外，口腔内其他部位的微生物可再定植于牙周袋内。因此，临床上通常会使用抗菌药物作为机械性治疗的补充。常规抗菌药物有硝基咪唑类、四环素类、羟氨苄青霉素类等。但长期使用抗菌药物不仅会使细菌耐药性增强，还会导致患者口腔和肠道菌群紊乱，甚至出现牙齿染色、呕吐和腹泻等副作用。黄芩是许多中药制剂的常见成分，它可用于炎症、高血压、心血管疾病以及细菌和病毒感染的治疗。黄芩的主要活性成分是黄芩苷(baicalin，BC)，它是从黄芩根中分离得到的黄酮类天然化合物。研究发现黄芩苷具有多种不同的药理活性，如抗菌、抗炎和抗氧化等[1]，使其有望成为预防和治疗牙周炎的有效药物。本研究从黄芩苷对牙周炎致病菌的抗菌作用、对促炎介质的影响、对先天免疫反应的影响和对牙周组织的保护作用等四个方面综述使用其预防和治疗牙周炎的药理机制和疗效，为在牙周疾病中应用传统中药黄芩苷提供参考。

1 黄芩苷的抗菌作用

牙菌斑生物膜是引起牙周炎的主要致病因素。致病菌可以激活宿主免疫细胞，产生各种促炎介质和细胞因子，破坏牙周支持组织。因此，抗菌是牙周炎预防和治疗的重中之重。许多研究发现黄芩苷在抗菌方面具有突出的表现，可能的抗菌机制有：抑制核酸合成、抑制细胞膜功能、抑制能量代谢和抑制生物膜形成等[2]。Tsao等[3]研究汤剂黄芩苷对牙龈拟杆菌(B.gingivalis)、黑素原拟杆菌中间体(B.mel.ss intermedius)、具核梭杆菌(F. nucleatum)、放线菌(A.naeslundii)、放线杆菌(A.actinomycetemcomitans)、粘性放线菌(A.viscosus)等牙周致病菌的抑菌和杀菌作用，发现黄芩苷在较高浓度下对革兰氏阴性菌的抑制效果更佳。其中，黑素原拟杆菌中间体对黄芩苷最敏感，而粘性放线菌敏感性最低。在对黄芩苷与其他抗菌药物联用的研究中发现，使用纳米颗粒包裹以9∶1(w/w)比例组合的黄芩苷和氯己定，更能控制黄芩苷持续有效的释放，并对含具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌和放线杆菌的混合性口腔细菌生物膜有协同抗菌作用，最低抑菌浓度(minimun inhibitory concentration，MIC)为12.5 μg/ mL[4]。Jang[5]的研究也证明了黄芩苷与氨基青霉素或庆大霉素联用对11种口腔常见细菌具有协同杀灭作用，联用后氨基青霉素的MIC值降低4倍，庆大霉素的MIC值降低4～8倍。

黄芩苷单独用药时的抗菌活性较为明确，但在与其他抗菌药物联用时，能否与其他药物产生协同作用还需要进一步探索。另外，黄芩苷作为抗菌药在使用时强调最低抑菌浓度，所以，一般以含药牙膏或漱口水的方式用药[6]。

2 黄芩苷对促炎介质的影响

产生促炎介质是牙周炎发展过程中必不可少的一环。一般参与炎症反应的促炎介质有环氧合酶(cyclo-oxygen-ase，COX)、氮代谢产物、活性氧和各类细胞因子。因此，下调过度表达的促炎介质是治疗牙周炎的有效措施。

2.1 前列腺素E2(PGE2)和白细胞介素(interleukin,IL)

PGE2是由活化的巨噬细胞和成纤维细胞产生的花生四烯酸环氧合酶代谢产物，是骨破坏的主要炎症介质。李敏等[7]研究发现黄芩苷(0.01～10 μg/mL)可抑制牙周膜细胞(Periodontal ligament cells，PDLCs)中IL-1β诱导产生的PGE2。白细胞介素作为合成PGE2的增强剂，也受到黄芩苷的调节。IL-1β是一种典型的细胞因子,可在牙周组织感染状态下引发炎症反应[8]。IL-8对中性粒细胞的移动起着重要作用[8]。这些炎性细胞因子通过与牙周炎原体的相互作用，达到破坏牙周支持组织的效果。Chung[9]的研究发现黄芩苷浓度在1 μg/mL时，可导致单核细胞中IL-1β的分泌量减少50%以上，此外，还可减少牙龈成纤维细胞中IL-1β诱导的PGE2水平。研究者们也通过牙周炎动物模型探索了黄芩苷对白细胞介素的调节作用。Zeng等[10]在小型猪牙周炎模型中，每两周在牙周袋内注入黄芩苷凝胶(122.4 μg/mL)，龈沟液中IL-1β的水平明显降低。在结扎下颌第一磨牙的牙周炎大鼠模型中，黄芩苷以100 mg/kg/day的剂量喂食14 d，可减少细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA在牙龈组织中的表达[8]。但是Li等[11]发现纳米粒子包封的黄芩苷在人类牙龈上皮细胞中并没有明显下调IL-6和IL-8的表达水平。鉴于目前的研究结果尚无一致定论，因此，还需进一步研究黄芩苷对白细胞介素的调控机制。

2.2 环氧合酶-2(COX-2)

COX-2是炎症部位的PGE2诱导酶，以往的研究发现抑制牙周组织中COX-2的表达可改变牙周炎的病程进展，这表明COX-2在牙周炎中具有促炎作用。Cai等[12]发现黄芩苷(200 mg /kg/day)可以明显抑制牙周炎小鼠模型中巨噬细胞、浆细胞、成纤维细胞和牙龈组织COX-2的蛋白表达。细胞学研究结果表明，黄芩苷在浓度为0.01 μg/mL时能显著抑制人牙周膜细胞(Human periodontal ligament cells，HPLCs) 中由IL-1β诱导的COX-2 mRNA的表达水平[13]。

2.3 核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)

RANKL作为肿瘤坏死因子配体家族的一员，通过激活炎症反应和诱导破骨细胞分化来参与牙周炎的发展，其在破骨细胞前体分化到破骨细胞过程中发挥重要作用。由成骨细胞谱系细胞产生的RANKL与骨髓细胞表面的核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)结合，RANKL-RANK信号通路激活核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)及c-Myc等，从而促进破骨细胞成熟分化及行使功能[14]。细胞学研究结果表明,黄芩苷能抑制HPLCs中由IL-1β调节的RANKL mRNA表达水平，最有效的浓度为0.01 μg/mL，同时还发现IL-1β诱导的COX-2也可被黄芩苷抑制，这表明黄芩苷可能通过抑制IL-1β诱导的COX-2的表达从而抑制RANKL的mRNA表达。

3 黄芩苷对先天免疫反应的影响

Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)是一种I型跨膜蛋白，用于识别微生物成分并介导先天免疫反应的激活。TLR在牙周炎的病理过程中起着双重作用。一方面，TLR可以通过对微生物的识别来激活先天免疫反应，维持牙周健康。另一方面，TLR受到长期刺激会使促炎介质水平过度升高，最终导致牙周组织的破坏。微生物脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)可以利用TLR2和TLR4激活p38有丝分裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)、JNK和NF-κB通路，从而导致促炎介质的释放进而造成牙槽骨的吸收[15]。这表明调节TLR的表达及其下游信号通路可能是治疗牙周炎的另一种方法。动物实验研究数据表明，在大鼠牙周炎模型中黄芩苷以100 mg/kg/day或更高浓度给药，可显著降低牙龈组织中TLR2和TLR4的表达水平，此外，黄芩苷还以剂量依赖的方式降低了MyD88的表达水平和p38 MAPK的磷酸化[16]。细胞学研究结果与动物研究结果一致。Wu等[17]用黄芩苷对金葡菌感染的成骨细胞(MC3T3-E1)进行干预，黄芩苷可抑制MC3T3-E1细胞中TLR2表达和MAPK信号通路激活，还可以提高碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨桥蛋白(osteocalcin,OCN)和 I型胶原蛋白(collagen type I，COL-I)等成骨标志物的表达水平。黄芩苷与先天免疫反应和促炎介质的相互关系如图1所示。

图1黄芩苷影响先天免疫反应和促炎介质的通路机制

4 黄芩苷对牙周组织的保护作用

随着牙周炎的发展，在细菌和炎症反应的双重作用下牙周支持组织会遭到破坏，如结缔组织的断裂和骨吸收。因此，对损伤组织进行保护和修复也是牙周治疗的目的之一。动物实验研究发现，黄芩苷对炎症状态下的牙周组织有保护作用。研究人员对大鼠上颌第二磨牙的牙颈部进行结扎,并接种牙龈卟啉单胞菌4周，以诱发牙周炎。结果发现，使用100mg/kg/day或200mg/kg/day的黄芩苷治疗可明显减少因细菌感染而产生的牙槽骨吸收，改善牙周组织的形态[16]。Zeng等[10]在小型猪牙周炎模型中也发现黄芩苷能显著提高牙周炎状态下的牙槽骨密度和高度，还能促进牙槽骨的修复和再生。细胞学实验研究也发现，黄芩苷对炎症状态下的牙周组织有保护作用。

4.1 牙周膜细胞(PDLCs)

PDLCs被认为是牙周组织再生和修复最有效的细胞来源之一，PDLCs在一定条件下具有向成骨细胞、脂肪细胞或神经源性细胞分化的潜力，其功能是负责牙周膜的形成和维护,以及邻近牙槽骨修复、重建和再生。所以，促进PDLCs分化成骨的药物可能对牙周炎症组织修复有一定的价值。李昂等[18]发现黄芩苷(0.1～1 mg/L)对PDLCs中COL-I 表达有促进作用，还能显著提高ALP的活性，促进细胞成骨分化。还有研究表明，黄芩苷在0.15～0.6 mg/L浓度范围可以促进HPLCs增殖、基质矿化和形成钙结节[19]。Chen等[20]研究了黄芩苷促进HPLCs成骨分化的机制，发现黄芩苷通过激活Wnt/β-儿茶素通路，上调相关因子如β-儿茶素，淋巴增强因子和细胞周期蛋白D1，促进成骨相关的转录因子-2(RUNX2)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein,BMP-2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix，OSX) 和OCN等成骨相关标志物的表达，从而提高HPLC成骨分化的能力。但该实验的局限性在于HPLCs是一个混合细胞群，由于含有高比例的终末分化细胞，其分化潜力有限。

4.2 成骨细胞(osteoblast，OB)和破骨细胞(Osteoclast，OC)

破骨细胞与成骨细胞之间的平衡是维持正常骨量的关键，破骨细胞与成骨细胞相互协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。Guo等[21]发现黄芩苷(50 μmol/L)可以通过激活Wnt/β-儿茶素信号通路促进体外培养的成骨细胞分化，并提高OCN和COL-I等成骨分化标志物的mRNA水平。然而，在对黄芩苷干预破骨细胞的研究中发现，黄芩苷的浓度对其具有双重效应。破骨细胞成熟分化的经典通路是RANKL和M-CSF通路[22]。Lu L等[22]研究了不同浓度下的黄芩苷对体外培养破骨细胞分化和骨吸收的双重作用，发现10-7-10-6mol/L的黄芩苷可促进破骨细胞成熟和功能化，高剂量的黄芩苷(10-5mol/L)抑制破骨细胞的成熟。他们认为黄芩苷通过与RANK对接，激活p-ERK/Mitf信号通路来调节破骨细胞分化，破骨细胞发生标志物基因c-Fos、c-Src、NFATc1、MMP9、TRAP、CtsK和OSCAR的表达被黄芩苷上调。Lu X等[23]得出的体内体外实验结果与前者的研究一致，同样发现黄芩苷以浓度相关的方式对破骨细胞产生双向调节作用。具体而言,低浓度(低于1 μmol/L)的黄芩苷增强了破骨细胞的分化和骨吸收，而高浓度(2 μmol/L以上) 的黄芩苷对破骨细胞表现出相反作用。具体机制是在低剂量时黄芩苷通过上调ERK/c-Fos/NFATc1，加强了RANKL诱导的破骨细胞成熟分化通路，造成了破骨细胞成熟分化和骨吸收，然而在较高浓度下黄芩苷不仅抑制了ERK磷酸化和c-Fos及NFATc1的表达，而且改变了凋亡相关蛋白的表达，从而抑制了破骨细胞的功能。黄芩苷对破骨细胞的影响机制如图2所示。

图2不同浓度黄芩苷对破骨细胞分化的影响机制

尽管实验证实了黄芩苷对破骨细胞分化成熟的双重作用，但现有研究并没有完全解释黄芩苷双重作用的分子机制。黄芩苷的这些双重作用表明其具有治疗破骨细胞相关疾病的潜力，但需谨慎对待药物剂量所产生的功能差异。

5 讨论

本文综述了黄芩苷预防和治疗牙周炎的药理机制和疗效。大多数研究都是围绕黄芩苷在牙周组织炎症微环境中的分子作用机制。总之，黄芩苷可从上述四个方面控制牙周炎，它们之间的相互作用在牙周炎的预防和治疗中建立了一个完整系统。黄芩苷可以通过直接抑制NF-κB的活性，下调相关的促炎介质,减少组织的氧化应激,从而控制炎症。此外,黄芩苷还可通过对TLR信号的负调节，抑制NF-κB的活性，同时也可直接抑制IL-6和IL-8的表达。

黄芩苷表现有独特的药代动力学特性，包括胃肠道水解，肝肠循环，载体转运穿过细胞膜和排泄到胆汁和尿液中。黄芩苷在体内的吸收代谢会受到其他联用药物的影响，因为，它们会互相竞争代谢酶和结合蛋白质。另外，某些特定的疾病也会改变转运体和酶的功能，继而影响黄芩苷在体内的分布与吸收。因此，使用黄芩苷时应考虑个性化方案和用药安全性。虽然黄芩苷具有良好的稳定性和生物活性，但它们的溶解度差、半衰期短、生物利用度低，研究证明其在体内的生物利用度仅有2.2%[24]，这些因素严重限制了其在生物医学方面的应用。为了解决其溶解度和生物利用度的问题，现已研究出新型黄芩苷制剂,如纳米级黄芩苷载药系统,该系统在临床前研究中表现出了较高的吸收度。此外，局部用药方式有望提高药物利用率。

总之,现有的研究很大程度上支持了黄芩苷在预防和治疗牙周炎中的治疗作用。然而目前关于黄芩苷对牙周炎症影响的研究还有局限性，其基本机制尚未明确，还需更进一步的研究，为临床牙周治疗提供更科学的依据。