一测多评法测定葛酮通络胶囊中5种成分的含量

牛海军，孙旭群，李晓亮，李光辉，路大勇，杨小梅，李玉梅

(1.安徽九方药物研究院有限公司 研发部，安徽 合肥 230088；2.安徽医科大学第一附属医院 药剂科，安徽 合肥 230022；3.安徽九方制药有限公司 研发部，安徽 亳州 236800)

葛根通络胶囊是从豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根中提取纯化并制剂成型，为葛根总黄酮单体植物药，其有效成分总黄酮含量达到80%以上，远高于国内外其他植物黄酮类制剂，其具有活血化瘀之功效，用于缺血性中风中经络恢复期瘀血痹阻脉络证，症见半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、语言不利、头晕目眩、颈项强痛等，动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞和腔隙性脑梗塞见上述证候者[1-2]。本公司多年来致力提高本产品质量控制，采用高效液相色谱法等不同分析手段，对本品黄酮类成分进行测定作为质量控制手段，并建立了其指纹图谱的测定方法[3-7]。以往常利用单品对照外标法测定各个有效成分含量，用到的对照品较多以致成本较高、工序复杂，限制了此法在企业实际生产中的应用。一测多评法(QAMS)[8-18]可在对照品较少的情况下对中药及其制剂进行快速、低成本质量控制，所以本研究采用一测多评法测定葛酮通络胶囊中5种成分含量，进一步提升质量标准。

1 仪器与试剂

岛津LC-10AT液相色谱仪，包括LC-10AT色谱泵、SPD-M10Avp DAD检测器、SIL-10A自动进样器、Lcsolution色谱工作站。甲醇和乙腈均为色谱纯，美国天地公司；其他试剂均为分析纯。3＇-羟基葛根素对照品：成都普瑞法科技开发有限公司，批号：15052309；葛根素对照品：中国食品药品检定研究院，批号：752-200108；3＇-甲氧基葛根素对照品：上海源叶生物科技有限公司，批号：P25D6F8070；葛根素芹菜糖苷对照品：上海源叶生物科技有限公司，批号：P09J7F8770；大豆苷对照品：成都普瑞法科技开发有限公司，批号：15031507。葛酮通络胶囊：安徽九方制药有限公司，批号：180401、180402、180602、180702、180801、180802、180901、180902、181101、181201。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相为甲醇-乙腈(70∶30)和0.05%磷酸溶液二元梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长250 nm，色谱柱为ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，所有组分在50 min内洗脱完全。见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 混合对照品溶液制备

分别精密称取3＇-羟基葛根素对照品、葛根素对照品、3＇-甲氧基葛根素对照品、葛根素芹菜糖苷对照品和大豆苷对照品适量，用甲醇稀释成1 mL含葛根素100μg、3＇-羟基葛根素对照品10 μg、3＇-甲氧基葛根素对照品10 μg、葛根素芹菜糖苷对照品10 μg和大豆苷对照品10 μg的混合溶液，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取葛酮通络胶囊内容物，混匀，研细，取约10 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加70%甲醇适量，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)20 min，放冷，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密量取对照品浓配液，用甲醇稀释成一系列对照品溶液。按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录5种成分的峰面积。以待测成分进样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，分别得到5种成分的回归方程和线性范围。见表2。

表2 5种成分的回归方程及线性范围

2.5 精密度试验

以葛酮通络胶囊(批号：180401)为供试品，按“2.3”项下方法制备1份供试品溶液，连续进样6次，分别记录5个成分的峰面积。结果峰面积的RSD值分别为0.21%、0.33%、0.25%、0.11%、0.28%(n=6)，试验结果表明本方法精密度较好。

图1混合对照品色谱

峰1：3＇-羟基葛根素峰；峰2：葛根素峰；峰3：3＇-甲氧基葛根素峰；峰4：葛根素芹菜糖苷；峰5：大豆苷峰

2.6 稳定性试验

以葛酮通络胶囊(批号：180401)为供试品，按“2.3”项下方法制备1份供试品溶液，分别在室温放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，测定其峰面积，5种成分24 h内峰面积的RSD值分别为0.18%、0.32%、0.79%、0.81%、0.37%(n=6)，试验结果表明本法制备的样品溶液在24 h内稳定性较好。

2.7 重现性试验

以葛酮通络胶囊(批号：180401)为供试品，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，以“2.1”项下的色谱条件进行测定，5种成分峰面积的RSD值分别为0.57%、0.92%、0.76%、1.02%、0.56%(n=6)，试验结果表明本法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

取同一批样品适量，分别加入一定量的5种成分对照品，按照“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，以“2.1”项下的色谱条件进行测定，计算加样回收率及RSD值。结果5种成分的回收率依次为98.1%、99.8%、97.7%、100.3%、98.5%，RSD值分别为1.23%、0.81%、1.55%、1.07%、0.93%，试验结果表明本法准确度较好。

2.9 相对校正因子(RCF)计算

本研究以葛根素为内标物，按照一测多评法公式计算，结合混合对照品溶液测得的峰面积，计算葛根素对另外4种成分的RCF值。结果3＇-羟基葛根素、3＇-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷和大豆苷的RCF值分别为0.993、1.054、0.965、1.025。

2.10RCF耐用性考察

本研究中考察了不同仪器设备和不同的色谱柱(250 L×4.6 mm，5 μm)对RCF测得结果的影响，结果见表3，表明本次考察的仪器和色谱柱耐用性较好。

表3 不同仪器和色谱柱测得的RCF

2.11样品的含量测定

分别取葛酮通络胶囊10批次样品适量，按照“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，以“2.1”项下的色谱条件进行测定，对比一测多评法(QAMS)与外标法曲线法(ESM)测得的5种成分的含量，结果见表4。结果表明2种方法测定的3＇-羟基葛根素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷和大豆苷的含量无明显差异。

表4 不同仪器和色谱柱测得的RCF (mg/粒)

3 讨论

葛酮通络胶囊是由葛根总黄酮与适量辅料经加工制成的胶囊。葛根总黄酮从植物葛根中经提取分离、纯化得到的黄酮类成分，是目前唯一的葛根总黄酮单体植物药，其有效成分总黄酮含量达到72%以上。目前该标准为新药转正标准第79册，其含量测定中仅以葛根素单一成分作为质量控制指标，存在一定的局限性，本研究的建立能更好地控制产品的质量。

研究中采用DAD检测器对供试品溶液在200～400 nm进行扫描生成三维色谱图，对不同波长下的色谱图进行分析，结果在主成分葛根素的最大吸收波长250 nm下，能够检出其余4种成分峰，且各峰响应值较大，因此选定 250 nm为测定波长。

本研究以葛根素为内标物，使用外标曲线法与一测多评法测定4种成分的含量无明显差异，本法操作简便，稳定性较好，检测成本较低。由于葛根素对照品价廉易得，性质稳定，所以选择葛根素为内标物。

本研究中建立的一测多评法稳定性、重复性、精密度均较好，且采用了多批次样品的验证，可用于评价葛根通络胶囊质量的真实性、优良性和稳定性。