葛根素对人肺癌A549细胞株迁移与侵袭的作用及分子机制研究

徐正馨，白静慧

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110000；2.辽宁省肿瘤医院，辽宁 沈阳 110000)

在全球范围内，肺癌是各种癌症类型中发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。即使有各种医治方法不断涌现，肺癌的总体生存率表现仍不乐观[1-2]。常规放化疗和靶向治疗等会不可避免地导致毒副反应和耐药性等一系列问题，此时毒副作用小的天然中药抗肿瘤成分成功吸引了人们的关注。葛根素是一种从中药材野葛根中提取出来的异黄酮类化合物，具有降压、降糖、抗骨质疏松、抗氧化、抗炎、抗癌等多种活性[3]。大量实验发现葛根素对多种癌症均有一定治疗效果。有研究[4-6]指出葛根素对人肺癌A549细胞的增殖和凋亡有明显抑制效果，但其对人肺癌A549细胞的迁移及侵袭作用尚未有研究。因此本研究将初步探索葛根素对人肺癌A549细胞迁移和侵袭力的影响，以期为葛根素对肺癌的治疗作用提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

人肺癌A549细胞株由辽宁省肿瘤医院中心实验室惠赠；胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素及RPMI1640培养基购于美国Gibco公司；CCK-8试剂购于苏州宇恒生物科技有限公司；ELISA、Transwell试剂盒购于美国Corning公司；葛根素购于美国Sigma公司，DMSO溶解，制备成100 mmol/L的葛根素原液，无血清培养基稀释成实验所需浓度，过滤，-20 ℃储存。

1.2 细胞培养与分组

采用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素的RPMI 1640培养基，在37 ℃恒温孵箱中培养A549细胞，当细胞处于对数生长期时，胰酶消化，传代，继续培养。设置阴性对照组，仅为细胞混悬液，不加葛根素处理。葛根素组加入不同浓度(5、10、20 μmol/L)的葛根素溶液，每组设5个复孔。

1.3 CCk-8检测葛根素对人肺癌A549细胞增殖活力的影响

将5×104个/mL人肺癌A549单细胞混悬液以100 μL/孔的浓度均匀接种于96孔板，24 h后细胞贴壁，加入不同剂量的葛根素溶液(5、10、20 μmol/L)，分别处理24 h、48 h及72 h。培养结束后，阴性对照及葛根素组每孔加入100 μL含0.1%血清的RPMI1640培养基稀释后的CCK-8溶液，终浓度为10%，37 ℃条件下避光反应1.5 h后，在酶标仪450 nm处测其OD值，采用细胞增殖抑制率公式：(阴性对照组OD值-加药组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100%，计算细胞增殖情况。

1.4 Transwell法检测葛根素对人肺癌A549细胞迁移能力的影响

常规培养A549细胞，待细胞贴壁后，弃旧培养基，加葛根素溶液(5、10、20 μmol/L)，处理24 h，胰酶消化，用不含血清的培养基重悬成的(1×105个/mL)单细胞悬液，接种于上层小室，200 μL/孔，小室下层加含胎牛血清的600 μL完全培养基，37 ℃下培养24 h。甲醛固定15 min，HE染色15 min，采用倒置显微镜观察细胞迁移情况，计算细胞迁移率，迁移率=实验组/对照组×100%，结果以细胞迁移率(%)表示。

1.5 Transwell检测葛根素对人肺癌A549细胞侵袭能力的影响

准备包被好Matrigel基质胶的transwell小室，在贴壁细胞中，分别加5、10、20 μmol/L葛根素溶液，干预24 h，胰酶消化，用不含血清的培养基制备A549单细胞悬液，3×105个/mL，200μL/孔加入上层小室，下层小室为600 μL含血清的完全培养基，培养24 h后，用棉签轻轻擦去上室聚碳酸酯膜内侧面细胞，用PBS清洗2次，甲醛固定15 min，HE染色，倒置显微镜观察侵袭情况，侵袭率=实验组/对照组×100%(%)。

1.6 ELISA法检测葛根素对人肺癌A549细胞炎性因子表达水平的影响

收集侵袭实验中小室上层的细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明，对人肺癌A549细胞炎性细胞因子IL-6、TNF-α与炎症趋化因子MCP-1、TGF-β的表达情况进行检测。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 葛根素对人肺癌A549细胞增殖活力的影响

采用CCK-8法检测不同浓度葛根素溶液(5、10、20μmol/L)处理A549细胞24、48、72 h后人肺癌A549细胞的增殖活力。结果显示葛根素抑制了人肺癌A549细胞的增殖，在时间和剂量上存在交互作用，F=28.620，P<0.05。剂量和时间的F值分别为F=603.605，P<0.05；F=461.129，P<0.05。结果见表1和图1。为观察葛根素对人肺癌A549细胞迁移和侵袭力的影响，选用24 h，浓度为0、5、10、20 μmol/L的葛根素对人肺癌A549细胞进行干预。

组别24h48h72h阴性对照组000葛根素5μmol /L组8.86±1.06①15.78±1.72①26.18±1.79①葛根素10μmol /L组15.10±1.62①②27.68±2.10②③44.06±2.92②③葛根素20μmol /L组23.74±2.2①②③44.36±3.42①②65.06±5.46①②

注：①与对照组比较，②与葛根素5 μmol/L组比较，③与10 μmol/L组比较，P<0.05。

图1葛根素对人肺癌A549细胞增殖抑制率的影响

2.2 葛根素对人肺癌A549细胞迁移率的影响

细胞迁移是肿瘤进展的重要原因，通过细胞迁移实验，本研究发现不同浓度葛根素(5、10、20 μmol/L)干预24 h后，与阴性对照组比较，明显降低了人肺癌A549细胞的迁移率(P<0.05)，并呈现剂量依赖性，见图2。

2.3 葛根素对人肺癌A549细胞侵袭力的影响

为了进一步观察葛根素对人肺癌A549细胞侵袭能力的影响，采用transwell法进行侵袭实验，结果显示葛根素(5、10、20 μmol /L)干预24 h后，与阴性对照组(0 μmol /L)比较，显著抑制了人肺癌A549细胞侵袭率(P<0.05)，见图3。

2.4 葛根素对人肺癌A549细胞炎性细胞因子表达的影响

采用ELISA法检测不同浓度葛根素(5、10、20 μmol/L)干预人肺癌A549细胞24 h后细胞炎性因子的表达情况。结果表明，与对照组比较，不同浓度葛根素作用的肺癌A549细胞炎性细胞因子IL-6、TNF-α与炎症趋化因子MCP-1、TGF-β的表达情况均明显下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

注：与阴性对照组比较，**P图3葛根素对人肺癌A549细胞侵袭的影响

组别TGF-βMCP-1 TNF-αIL-6阴性对照组85.23±9.1471.26±8.71364.78±18.56231.24±13.72 葛根素5μmol /L组75.46±8.27①60.53±6.57① 315.16±14.21①190.31±10.14①葛根素10μmol /L组58.62±6.37①②47.48±5.19①②253.36±10.34①②109.64±7.35①②葛根素20μmol /L组36.74±3.75①②③23.14±2.85①②③164.17±5.36①②③52.87±3.47①②③

注：①与对照组比较，②与葛根素5 μmol/L组比较，③与10 μmol/L组比较，P<0.05。

3 讨论

传统中草药中含有多种有效成分[8-9]，其在临床治疗疾病的过程中起着极为重要的作用。黄酮类化合物是多种中药的有效成分之一，具有多种生物学活性[10]。葛根素即是从干燥野葛根中提取出来的一种天然黄酮类化合物，临床广泛应用于心脑血管疾病、糖尿病、骨质疏松症及癌症等多种疾病的治疗[11-13]。本研究结果表明，葛根素可以抑制人肺癌A549细胞的增殖、迁移及侵袭。炎症与癌症的发生发展密切相关，慢性炎症可促进癌症的进展[14-15]。大量研究[16-19]发现葛根素具有显著抗炎活性，可通过降低炎性细胞因子、抑制炎症趋化因子等表达治疗多种疾病。炎症相关因子在肿瘤细胞的增殖、侵袭转移中发挥着重要作用[20]，为此本实验检测了葛根素干预后人肺癌A549细胞炎症相关因子的表达情况，结果发现葛根素能显著降低人肺癌A549细胞IL-6、TNF-α、MCP-1、TGF-β的表达水平，表明其对人肺癌A549细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用可能与下调炎症相关因子表达有关。

综上所述，本实验初步阐明葛根素可以通过其抗炎作用下调炎症相关因子表达，进而抑制人肺癌A549细胞的增殖、侵袭与转移。为了更深层次地探究葛根素对人肺癌A549细胞的侵袭转移的抑制作用，今后将从基因-蛋白组学水平探究葛根素对人肺癌细胞侵袭、转移及炎症等相关基因、蛋白信号通路的影响，使其应用于肺癌临床治疗的前景更加广阔。