基于“肾藏精”理论探讨不同生长发育期大鼠股骨Klotho mRNA及蛋白表达

任慧敏，陈 伟，罗运凤，吴雍真，王宗陵，柴艺汇，陈云志*

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.温州医科大学附属第一医院永嘉分院，浙江 温州 32510)

肾为先天之本，构成人体生命之本元，肾藏精主骨。中医认为，人体的生长发育受肾中所藏之精的推动调控及骨髓滋养，关于肾与骨关系的描述最早出现在《黄帝内经》中，《素问·五脏生成论》言：“肾之合，骨也”；《素问·六节藏象论》曰：“肾者主蛰，…精之处也，其充在骨”；《素问·阴阳应象大论》云：“肾生骨髓，在体为骨，肾应骨州”，说明肾与骨密切相关。肾中精气充沛，则生长发育正常，形体健硕肌肉丰满，骨骼强壮；肾中精气亏虚则骨质失养而形体痿弱肌肉瘦削，骨骼无力。目前的研究证实Klotho和肾藏精之间存在着内在关联。Klotho是1997年Makoto Kuro-o发现的抗衰老基因，在肾脏和脑脉络膜具有高水平表达，突变后可在所有的器官中表达[1]，并能通过调控维生素D和钙、磷代谢，保护心血管及内分泌系统等途径，对衰老等疾病进行调节[2]。研究表明，在Klotho基因缺陷的小鼠模型中表现出多个脏器功能早衰的症状，如骨质疏松、听力下降、血管钙化、皮肤衰老、性功能减退及高磷酸盐血症，甚至出现生长缓慢、寿命缩短等，与中医学中“肾精亏虚证”的临床表现非常近似[3]。反之，Klotho基因过表达的转基因小鼠与野生型小鼠相比平均寿命延长至20%以上[4]。当代医学阐明肾中所藏之精与支配生命过程的遗传物质不管是本原，还是推动人体的生长、发育、生育以及调节机体代谢等生理功能方面均拥有高度的一致性。目前，通过调查健康人的血清，发现Klotho 基因表达水平在10岁之前较低，而在青壮年时期Klotho基因表达与年龄呈正相关，并于30～40岁达到高峰，之后Klotho基因随着年龄的增长而降低[5]。从肾精的兴衰过程验证了肾藏精与Klotho基因的紧密关系，有学者通过研究提出肾藏精的物质基础可能为Klotho[6]。因此，本研究拟通过研究Klotho mRNA及蛋白表达的改变，初步探讨Klotho基因是肾藏精的物质基础之一。

1 材料

1.1 试剂

苏木素(珠海贝索生物技术有限公司，批号：BA-4097)；伊红溶液(珠海贝索生物技术有限公司，批号：BA-4099)；Trizol总RNA提取试剂(Aidla公司，批号：252250AX)；HiScript Reverse Transcriptase(VAZYME公司，批号：R101-02)；Ribonuclease Inhibitor(TANS公司，批号：J11202)；兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R 001)；兔多抗KLOTHO(Abcam公司，批号：Ab181373)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德有限公司，批号：BA1054)；HRP标记兔抗羊二抗(武汉博士德有限公司，批号：BA1060)。

1.2 仪器

2016转轮式切片机(德国徕卡公司)；MK-3酶标仪(Thermo 公司)；BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)；QuantStudio6实时荧光定量PCR仪(ABI公司)；垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；电泳仪电源(北京六一仪器厂)；蛋白印迹电泳系统(北京六一仪器厂)。

1.3 实验动物

清洁级大鼠总共32只，其中3月龄SD雌大鼠8只，体重为(209±20)g；9月龄SD雌大鼠8只，体重为(380±20)g；18月龄SD雌大鼠8只，体重为(439±20)g；1月龄SD雌大鼠8只，体重为(125±20)g；均购自于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2014-0011。

2 方法

2.1 分组

32只健康SD大鼠，分为4组，每组8只，即1月龄组、3月龄组、9月龄组、18月龄组大鼠，称重、标记。

2.2 取材

摘取大鼠右侧后腿股骨、左侧后腿股骨，-80 ℃保存；摘取大鼠左侧前腿股骨，4%多聚甲醛保存。

2.3 检测指标

2.3.1 HE染色法观察大鼠左侧前腿股骨生理结构变化将股骨进行组织脱水、包埋，切片脱蜡，用苏木素染色10～20 min，盐酸酒精分化5～10 s，放入50 ℃的温水中返蓝，自来水冲洗1～3 min，放入85%的酒精3～5 min，用伊红染色3～5 min，然后水洗3～5 s，通过梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，最后在光学显微镜下观察组织形态学变化。

2.3.2 PCR检测大鼠左侧后腿骨Klotho mRNA表达量按照超纯RNA试剂盒使用说明，从大鼠左侧后腿骨组织制备总RNA，取溶解后的RNA 2 μL用微量分光光度计测定OD260、OD280及OD260/OD280值，计算RNA的纯度和浓度。根据OD260/OD280比值，估测RNA质量，比值在1.8～2.0之间，根据吸光光度值计算样品RNA的浓度，在RNA逆转录酶及RNA酶抑制剂的作用下(Hiscript Reverse Transcriptase&Ribo-nuclease Inhibitor)以Oligo(dT)为逆转录引物，将总RNA逆转为cDNA，逆转录条件分别为25 ℃ 5min、50 ℃ 15min、85 ℃ 5min、4 ℃ 10 min，逆转完毕后将cDNA静置于-80 ℃冰箱备用。目的基因作为引物和以GAPDH作为内参基因，引物列为GAPDH，上游引物序列5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，上游引物序列5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT -3′，扩增产物长度253bp；Klotho上游引物序列5′-CATCCGACGAGGACTCTTCTA-3′，下游引物序列5′-GCACATCCCACAGATAGACA -3′，扩增产物长度242bp。PCR实验需重复3次，每次3 个复孔，根据Real-time PCR原始数据Ct值，并计算相对定量值。

2.3.3 Western blot检测大鼠右侧后腿骨Klotho蛋白表达量提取股骨组织中的总蛋白，分装并置于-20 ℃保存。依据标准蛋白浓度和相应OD值得出直线回归方程，代入样品OD值，计算样品浓度。制胶、电泳、转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST室温摇床封闭2 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜。次日，TBST洗膜，加入二抗(1∶5 000)，37 ℃摇床孵育2 h。ECL发光显影，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 HE染色法观察大鼠左侧前腿股骨生理结构变化

实验结果显示，1月龄组骨干部位密质骨较薄，部分部位密质骨不连续，内侧骨髓腔内少量骨小梁形成，骨小梁体积较小；与1月龄组比较，3月龄组骨干部位密质骨增厚，骨组织完整、连续，骨髓腔内骨小梁明显增多，体积变大；与3月龄组比较，9月龄组骨骺内骨小梁增粗，体积变大，骨髓腔内骨小梁增多，并出现较多且较为明显的裂纹，少量骨细胞发生坏死；与9月龄组比较，18月龄组的骨髓腔内骨小梁明显减少；骨干内骨组织和骨髓腔内骨小梁出现大量裂纹，骨细胞发生坏死。见图1。

注：a：1月龄组；b：3月龄组；C：9月龄组；D：18月龄组

3.2PCR法检测大鼠左侧后腿股骨Klotho mRNA表达量的变化

结果显示，与18月龄组比较，1月龄组、3月龄组股骨Klotho mRNA表达上升(P<0.05)，和9月龄组的Klotho mRNA表达无明显差异，见表1。

表1 PCR法检测大鼠左侧后腿股骨Klotho mRNA表达情况 (n=8)

注：与18月龄组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 Western blot检测大鼠右侧后腿股骨Klotho蛋白表达量

结果显示，与18月龄组比较，1月龄组及3月龄组股骨Klotho蛋白表达显著升高(P<0.01)，和9月龄组Klotho蛋白表达水平无明显差异。见图2，表2。

表2 Wb法检测大鼠右侧后腿股骨Klotho mRNA表达情况 (n=8)

注：与18月龄组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：a：1月龄组；b：3月龄组；C：9月龄组；D：18月龄组

4 讨论

中医学认为“肾藏精主骨”，实质上是肾中精气促进人体生长发育功能的具体体现。肾藏精，精生髓，骨骼的生长发育依赖肾精的充盈、精髓的濡润及其所提供的养分，机体骨的生长与老化离不开肾精的滋养。《素问·上古天真论》陈述了女子与男子的生长发育规律：“女子七岁，肾气盛，齿更发长；二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子；……四七筋骨坚，发长极，身体盛壮；……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。男子八岁，肾气实，发长齿更；二八，肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子；……四八，筋骨隆盛，肌肉满壮；……七八天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极，八八则齿发去”，说明骨的生、长、壮、衰与肾中精气的兴衰密切相关，而最终导致肾中精气逐渐亏虚的首要原因是岁数增长[6]。肾精充足则骨质生化有本有源，骨骼受到充养、坚固有力强壮；若肾精亏损则骨质脆弱无力，容易出现骨质疏松、脆性骨折、腰膝酸软、侏儒、骨痛、骨痹、佝偻等症状[7]。

Klotho 是抗衰老基因，对人体生长发育、骨代谢、生殖及脂代谢等有重要影响，其生理功能与中医“肾藏精”理论，如肾“主骨代谢、主生长发育、主纳气、主水液代谢、主生殖等”有众多相近之处；在病理表现上，Klotho 基因下调与中医肾精亏虚、骨失充养也有着相通之处，其表现以成骨细胞数量下降，骨量减少为特征，并且补肾药物也可上调Klotho 基因的表达。因此，可认为Klotho基因是“肾藏精”的重要成分之一[7]。课题组通过前期研究认为，维生素D与中医“肾”的功能密切相关，并明确指出维生素D可能是“肾藏精”的重要物质基础之一[8，9]。此外，维生素D与Klotho关系密切。实验发现，1，25-(OH)2D3可刺激klotho蛋白的表达[10]，Klotho基因可通过相关途径调控维生素D体内平衡、骨形成、骨矿化及血磷浓度，从而调节骨的形成[11]。

本实验研究的HE染色结果显示，1月龄组骨干部位密质骨较薄，少量骨小梁形成，骨小梁体积较小；3月龄组骨干部位密质骨增厚，骨小梁明显增多，体积变大；9月龄组骨小梁增多，并出现较多且较为明显的裂纹，少量骨细胞发生坏死；18月龄组的骨小梁明显减少；骨干内骨组织及骨髓腔内骨小梁出现大量裂纹，骨细胞发生坏死。PCR实验结果显示，与18月龄组比较，1月龄组、3月龄组股骨Klotho基因表达上升(P<0.05)。Western Blot实验结果显示，与18月龄组比较，1月龄组及3月龄组股骨Klotho蛋白表达显著升高(P<0.01)；与9月龄组Klotho蛋白表达水平无明显差异。从实验结果可以看出，Klotho水平表达能反映骨的生长发育的变化情况。综上所述，肾藏精主骨与Klotho密切相关，其骨的生长和发育的可能和Klotho变化有关，但是尚不清楚其在作用过程中是否涉及其他机制，因此需要更进一步的研究。