不同豆类蛋白组成、结构和功能特性

惠君玉，熊江红，杨安树，陈红兵

(1.南昌大学a.食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；b.资源环境与化工学院； c.中德联合研究院，江西 南昌 330047；2.江西省精神病院，江西 南昌 330029)

豆科植物的年产量仅次于小麦、水稻、玉米和大麦，居世界第五位。我国豆类资源十分丰富，品种繁多，历史悠久，在全国各地都有种植与生产。豆类种子中含有丰富的蛋白质、油脂和碳水化合物以及维生素和矿物质等。豆科植物是现代保健功能食品开发的重要资源，尤其在那些因宗教、文化习惯等影响动物蛋白质消费受到限制的国家中[1],豆类是廉价、优质植物蛋白质的主要来源之一。

豆类蛋白不仅具有很高的营养价值，同时还具有多种功能特性(如持水性、持油性、起泡性、乳化性等)，且这些功能特性与豆类蛋白的氨基酸组成、亚基组成和结构等有密切关系；同时，不同功能特性之间相互作用，进而影响豆类蛋白在食品加工方面的应用。因此，为了豆类蛋白的高效利用和消费者的认可，深入研究豆类蛋白质的功能特性显得十分重要。

豆类蛋白具有许多有益人体健康的生理功能，如控制高胆固醇、2型糖尿病以及预防各种癌症和心血管疾病等[2]。近年来，不同品种豆类的研究引起了人们的日益重视。目前，国内外有关不同豆类的研究主要集中于品种的选育、功能因子生物活性探索和蛋白提取工艺优化等方面，如Dubey等[3]培育和开发抗旱大豆；Jayamanohar[4]等利用水提取红芸豆中多糖，并研究其益生元潜力；张英蕾等[5]报道了碱溶酸沉法从黑豆中提取蛋白的工艺优化。但在常见豆类蛋白的组成、结构差异及其对蛋白功能特性的影响等方面研究相对缺乏。蛋白质复杂的结构决定了其独特的功能特性。因此，本文选取10种常见的豆类为研究对象，探讨不同豆类中蛋白的氨基酸组成、结构和功能特性的差异，以期为豆类蛋白质资源的进一步开发利用提供参考。

1 试剂与材料

1.1 材料与试剂

豆类购于南昌大学天虹超市，大豆油购于旺中旺超市。

1.2 仪器设备

S433D氨基酸分析仪(北京捷盛依科科技发展有限公司)；高速分散机(德国IKA公司)；高效液相色谱仪(日本岛津公司)；紫外可见分光光度计(美国PE公司)；Mini垂直蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；F-4500荧光分光光度计(日本日立公司)；SQ-GS800光密度扫描仪(北京宇艾电子科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 豆类蛋白的提取

利用碱提酸沉法提取蛋白：将新鲜的豆类种子碾碎成粉末后，与石油醚混合，室温下搅拌2 h进行脱脂，重复3次，将脱脂豆粉与蒸馏水按照1:10(g·mL-1)比例混合后，用NaOH(1 mol·L-1)溶液调节pH值至8.0，室温下搅拌2 h后，离心(8 000 r·min-1)20 min取上清液，用 HCl(1 mol·L-1)溶液调节pH值至4.5；静置0.5 h后，于4500 r·min-1、4 ℃下离心20 min得到蛋白沉淀；最后将蛋白沉淀溶于去离子水，用NaOH(1 mol·L-1)溶液调节pH值至7.0，用透析袋透析24 h，6 h换1次水，冷冻干燥后于-20 ℃保存。

1.3.2 豆类蛋白的组成

1.3.2.1 氨基酸的测定

分别称取一定量的豆类蛋白粉置于水解管中，加入10 mL盐酸(6 mol·L-1)和1 mL苯酚，充氮气后在110 ℃下水解24 h，冷却后，分别将水解液进行过滤、定容。吸取样品1 mL于培养皿中，用真空干燥器在50 ℃干燥，加3 mL超纯水蒸干除去盐酸，重复 1次，加入3 mL上样缓冲液(pH 2.2)后，将待测样品用微孔滤膜(0.22 μm)过滤后，再利用氨基酸自动分析仪进行氨基酸含量分析[6]。

1.3.2.2 SDS-PAGE

利用SDS-PAGE分析不同品种豆类蛋白的分子量分布情况，操作详细步骤依据文献[7]进行。

1.3.3 豆类蛋白结构表征

1.3.3.1 紫外光谱分析

采用紫外可见分光光度计分析蛋白的空间折叠情况。设定紫外吸收光谱的波长扫描范围为200～500 nm，光径为1 cm，波长间隔1.0 nm，扫描速度为240 nm·min-1，样品浓度为0.2 mg·mL-1，室温下测定其吸光值，PBS溶液为空白对照。

1.3.3.2 表面疏水性分析[8]

用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH 7.0)将豆类蛋白稀释成0.2 mg·mL-1，取5 mL样品分别加入50 μLANS (8 μM) 溶液，在涡旋仪上搅拌混匀，室温避光反应1 h后，测其荧光强度。荧光光谱测定条件为：激发波长375 nm，发射波长400～650 nm，光径1 cm，扫描速度1 200 nm·min-1，狭缝宽度5.0 nm，响应时间2.0 s。

1.3.3.3 表面巯基的测定

将豆类蛋白用Tris-甘氨酸缓冲溶液(0.1 mol·L-1，pH 8.0)稀释至1.0 mg·mL-1，分别取5 mL样品稀释液加入40 μL Ellman溶液，在25 ℃下避光放置10 min，后在 412 nm处测上清液的吸光度。空白对照用Tris-甘氨酸稀释液。

1.3.4 蛋白质功能特性

1.3.4.1 持水性[9-10]

在已称重的离心管(m1)中分别加入一定量豆类蛋白粉(m)，然后分散、摇匀，使各蛋白可以充分吸水，室温(25 ℃)放置30 min，间隔10 min震荡1次，于离心机中4 000 r·min-1下离心25 min，去上清液，再将样品与离心管一同置于50 ℃下干燥25 min，使其管壁的残余水分挥发，后称质量为m2。

(1)

式中：m—样品质量g；m1—离心管质量g；m2—离心管和沉淀物质量g。

1.3.4.2 持油性[9-10]

称取0.20 g豆类蛋白(m)，加入已称重的离心管(m3)中，随后加入大豆油3 mL，搅拌1 min使其充分接触油脂，室温放置30 min，4 000 r·min-1下离心25 min，用移液枪吸去上层油脂，再将离心管倒置25 min，除去流出的油脂，后称质量m4。

(2)

式中：m—样品质量g；m3—离心管质量g；m4—离心管和沉淀物质量g。

1.3.4.3 起泡性和泡沫稳定性

用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH 7.0)将豆类蛋白样品配制为1 %的蛋白溶液，取30 mL样品于量筒中，用高速分散器以10 000 r·min-1的转速分散2 min。记录均质停止时泡沫体积数V1和停止后30 min的V2，起泡性与泡沫稳定性[11]按下式计算：

(3)

(4)

1.3.4.4 乳化性和乳化稳定性

用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH 7.0)将豆类蛋白样品配制为1%的蛋白溶液，加入大豆油(体积比3:1)，混合均匀后，于高速分散器(10 000 r·min-1)中分散2 min，从底部抽取样品液50 μL，用配制好的SDS溶液(0.1 %)稀释(体积比1:100)，记录其在500 nm下的吸光值A0。静置10 min后，从底部抽取样品液50 μL，再次按同体积比稀释后记录吸光值A10。乳化性与乳化稳定性[12]按下列公式计算：

(5)

(6)

式中：c-白质浓度g·mL-1

1.3.5 统计分析

所有试验均重复3次，数据为3次重复的平均值，数据处理采用Excel 2013与SPSS22.0进行数据统计与分析，并用 Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 豆类蛋白中氨基酸分析

氨基酸组成和含量是评价蛋白质营养价值重要指标，豆类蛋白的氨基酸组成接近人体需要，对豆类蛋白的营养进行分析尤为重要。由表1看出，在这10种豆类蛋白氨基酸组分中，均为Glu含量最高，Met含量最低，因此Met是豆类蛋白的第一限制氨基酸。Glu与Met中含量最高的豆类蛋白是豇豆蛋白。豆类蛋白中必需氨基酸含量丰富，含量较高的必需氨基酸是Leu与Lys，其中鹰嘴豆蛋白中必需氨基酸占总氨基酸含量百分比(EAA/TAA)最高为36.17%，豌豆蛋白EAA/TAA最低，为30.37%，其余豆类蛋白中EAA/TAA由高到低依次为：刀豆蛋白、豇豆蛋白、红豆蛋白、绿豆蛋白、芸豆蛋白、扁豆蛋白、大豆蛋白和黑豆蛋白。

表1 豆类蛋白中氨基酸组成(g/100 g蛋白)

2.2 SDS-PAGE分析

从图1中可以看出：不同品种的豆类蛋白组成之间有明显差异，豌豆蛋白(豌豆属，泳道1)的电泳条带颜色较浅，主要蛋白的分子量约75 kDa；芸豆蛋白(菜豆属，泳道2)的分子量主要介于32～55 kDa之间；而刀豆蛋白(菜豆属，泳道3)的分子量在17～130 kDa之间；扁豆蛋白(扁豆属，泳道4)在17～130 kDa之间均有少量分布；鹰嘴豆蛋白(鹰嘴豆属，泳道8)的分子量主要在17～95 kDa之间，有较多的亚基条带；绿豆蛋白、红豆蛋白、豇豆蛋白(泳道5—7)都属于豇豆属，其主要蛋白分子量在55～72 kDa之间。泳道9、10分别为黑豆蛋白与大豆蛋白，电泳图表明这两种豆类蛋白的组成相似，其主要成分为β-伴大豆球蛋白(7S)与大豆球蛋白(11S)，与文献[13]报道一致。其中，β-伴大豆球蛋白(7S)是由α′(约71 kDa)、α (约67 kDa)和 β (约50 kDa) 3种亚基[14]经疏水作用组成；而大豆球蛋白(11S)是由一个酸性多肽链A(约38 kDa)和一个碱性多肽链B(约20kDa)通过二硫键连接形成[15-16]。通过电泳结果表明：来源不同属的豆类蛋白，其所含的亚基和分子量有所不同。

M：Marker，1:豌豆，2:芸豆，3:刀豆，4:扁豆，5:绿豆，6:红豆，7:豇豆，8:鹰嘴豆，9:黑豆，10:大豆。

图1豆类蛋白的电泳图

2.3 豆类蛋白的结构

2.3.1 紫外光谱分析

紫外光谱的吸光度反映了蛋白质中芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)以及组氨酸和半胱氨酸的残基侧链基团对紫外光的吸收[17]。由紫外光谱图可以看出：各个豆类蛋白在波长280 nm处有最大吸收峰，不同豆类蛋白中，刀豆蛋白的紫外吸收最强，其次是红豆蛋白与绿豆蛋白，而鹰嘴豆蛋白的紫外吸光最弱，这可能是由于刀豆蛋白表面的色氨酸和酪氨酸含量较高，而其他豆类蛋白表面紫外生色基团的含量较低[18]。

2.3.2 表面疏水性分析

疏水作用是指氨基酸残基在水溶液中为了避开水相而相互聚集的一种非共价的相互作用，是维持蛋白质三级结构的重要作用力，且对蛋白质的功能性质具有重要的影响[19]。一般而言，蛋白荧光强度越大，其表面疏水性越强。由图3可知：在10种豆类蛋白中，豌豆的荧光强度最高，刀豆蛋白的荧光强度最低，并且豌豆蛋白与刀豆蛋白相比，荧光光谱最大发射峰出现了一定的蓝移，表明豌豆蛋白的表面疏水性最强，刀豆蛋白表面疏水性最弱，其他豆类蛋白表面疏水性由强到弱依次为大豆蛋白、红豆蛋白、绿豆蛋白、豇豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、黑豆蛋白、扁豆蛋白和芸豆蛋白。

2.3.3 表面巯基分析

豆类蛋白中含有较丰富的巯基与二硫键，球蛋白中大豆球蛋白(11S)的巯基含量高于β-伴大豆球蛋白(7S)，11 S蛋白分子中含有44个半胱氨酸残基(-Cys)[20]，而7S蛋白中仅含有4个半胱氨酸残基(-Cys)，可以通过测定蛋白表面游离巯基的含量来分析蛋白的结构。从图4中可以明显看出：豆类蛋白的巯基含量范围在 1.11～6.79 μmol·g-1之间，其中鹰嘴豆蛋白的表面巯基含量最高，为6.79 μmol·g-1，显著高于其他豆类蛋白的表面巯基含量，刀豆蛋白面巯基含量最低，为1.11 μmol·g-1。巯基与二硫键都对维系蛋白空间结构有着重要的作用，在体内和加工条件下，二者之间可实现相互转化，从而改变蛋白质的结构。

2.4 豆类蛋白的功能特性

2.4.1 持水性与持油性

持水性对食品的质构有很大影响，溶解度较高的蛋白质具有较好的分散性，可以形成良好的分散体系，因此提高了蛋白质的持水性[21]，而持油性与蛋白质分子表面亲油基团有关，对于改善产品口感、保持风味很重要[22]，所以持油性也是衡量蛋白功能特性的重要指标之一。由图5A可知：豆类蛋白的持水性存在显著差异(P<0.05)，刀豆蛋白的持水性最高为4.75 g·g-1；豌豆蛋白的持水性最低为2.42 g·g-1，这与上述豆类蛋白的疏水性研究结果相符合，也由此印证了蛋白疏水作用对其功能性质的影响。由图5B可以看出：黑豆蛋白的持油性最高是6.69 g·g-1，明显高于其他豆类蛋白，而刀豆蛋白与大豆蛋白的持油性相近，豇豆蛋白的持油性最低3.56 g·g-1。蛋白质持水性与持油性对食品的加工应用有重要意义，良好的持水性与持油性有助于食品在储藏期间的“保鲜”及“成型”。

2.4.2 起泡性及泡沫稳定性

起泡性和泡沫稳定性可以赋予加工食品保持疏松的结构和良好的口感，蛋白的起泡性是指蛋白质可以起泡的能力，而泡沫稳定性是指泡沫保持稳定的能力[23]。由图6可以看出，大豆蛋白起泡性最高(61.67%)，其泡沫稳定性也很高(75.96%)；其次是刀豆蛋白，具有良好的起泡性及泡沫稳定性；鹰嘴豆蛋白、豇豆蛋白、红豆蛋白和芸豆蛋白的起泡性较高，但是泡沫稳定性均偏低；绿豆蛋白、扁豆蛋白与豌豆蛋白的起泡性与泡沫稳定性都较低；而黑豆蛋白的起泡性最低(9.67%)，但其泡沫稳定性最高(88.69%)，这可能与豆类蛋白的结构及其蛋白质复合物在水与空气界面的相互作用相关[24]。有研究表明，泡沫主要是由溶解的蛋白质参与形成的，蛋白质的浓度越高，泡沫的黏度越大，可以在水与空气界面上形成多层的黏附性蛋白质膜；而溶解度低的蛋白质形成的泡沫较少，其对蛋白质的起泡力贡献很少,但这些不溶解的蛋白质分子由于静电吸附增加了蛋白质膜的黏合力,提高了蛋白的泡沫稳定性[25]。

2.4.3 乳化性及乳化稳定性

乳化性是指蛋白质在水油混合物中的形成乳液的能力[26]，表面疏水性、溶液pH值、离子强度、温度和油相体积等因素在一定程度上影响了蛋白的乳化性能，而乳化稳定性是指乳液对外界压力保持稳定的能力。由图7可以看出，黑豆蛋白的乳化性最高，其后依次是红豆蛋白、芸豆蛋白、豇豆蛋白，绿豆蛋白与刀豆蛋白的乳化性相近，而鹰嘴豆蛋白的乳化性最低。在乳化性稳定性方面，鹰嘴豆蛋白与刀豆蛋白的乳化性稳定性相对较高，而豇豆蛋白乳化性稳定性最低。综合考虑芸豆蛋白具有较好的乳化性及乳化稳定性。黑豆蛋白的乳化性最高，其持油性也最高，表明蛋白乳化性与其亲油基团有关联性。

3 结论

本文分析探讨了常见10种豆类中蛋白质的氨基酸组成、分子量范围、结构和功能特性。结果表明：在10种豆类蛋白的氨基酸组成中，均为Glu含量最高，Met含量最低，不同豆类蛋白中必需氨基酸含量占总氨基酸含量比最高是鹰嘴豆蛋白，最低是豌豆蛋白。不同豆类蛋白的亚基组成和分子量存在一定差异，芸豆蛋白的分子量主要在32～55 kDa之间；绿豆、红豆、豇豆等豇豆属豆类蛋白主要分子量在55～72 kDa之间；其他豆类蛋白的分子量分布范围较大，其中，黑豆蛋白与大豆蛋白的组成相似，主要成分为β-伴大豆球蛋白(7S)与大豆球蛋白(11S)。不同豆类蛋白的结构有所不同，刀豆蛋白紫外吸收最强，鹰嘴豆蛋白的紫外吸收最弱；豌豆蛋白的表面疏水性最强，刀豆蛋白表面疏水性最弱；鹰嘴豆蛋白的表面巯基含量最高，刀豆蛋白的表面巯基含量最低。蛋白质的加工特性方面，刀豆蛋白持水性最高，豌豆蛋白持水性最低；黑豆蛋白持油性最高，豇豆蛋白持油性最低；大豆蛋白和刀豆蛋白具有较好的起泡性和泡沫稳定性，黑豆蛋白泡沫稳定性最好，但起泡性较差；黑豆蛋白乳化性最好，但乳化稳定性较差，鹰嘴豆蛋白乳化性较差，而乳化稳定性最好，而芸豆蛋白具有较好的乳化性和乳化稳定性。因此，在以豆类蛋白为基料的食品加工中，可根据特定生产需要择优选取豆类品种；同时，针对某些豆类蛋白，通过适当的加工改性可拓展其功能特性的应用范围。