超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中三苯甲烷类染料和氯霉素类药物的残留量

2020-04-10万承波万建春罗秋红占春瑞

南昌大学学报（理科版） 2020年6期

万承波，万建春，罗秋红，占春瑞*

(1.江西省产品质量监督检测院，江西南昌 330052；2.南昌海关技术中心，江西南昌 330038)

三苯甲烷染料是一类工业染料，因其有较好的杀菌作用，它早期作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产养殖业中使用，用于预防与治疗各类水生动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病。氯霉素类药物是类广谱抗生素，能够预防和治疗动物各种细菌性疾病，早期被用于畜牧水产养殖[1]。三苯甲烷染料和氯霉素类药物具有残留时间长，三苯甲烷染料存在致癌、致畸、致突变等副作用[2]，氯霉素类药物也具有严重的毒副作用，它可以抑制骨髓造血机能，引起再生障碍性贫血和其他恶性血液病[3]，因此世界上许多国家都禁止这两类物质在水产养殖业的使用，我国农业农村部250号公告也将氯霉素和孔雀石绿列入《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》中。

目前水产品中孔雀石绿(Malachite green,MG)、结晶紫(crystalviolet,CV)、及其代谢物隐性孔雀石绿(1eucom alchite green,LMG)、隐性结晶紫(1eucocrysta lviolet,LCV)、氯霉素(Chloramphenicol，CAP)、甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)、氟甲砜霉素(Florfenicol，FF)残留量的检测方法的研制受到广泛关注，主要有免疫吸附法[4-5]、荧光光谱法[6]、高效液相色谱法[7-8]、气相色谱串联质谱法[9]，液相色谱串联质谱法[10-15]、液相色谱串联高分辨质谱法[16]，前处理采用乙腈或乙酸盐缓冲液提取，固相萃取净化富集等技术。气相色谱串联质谱法需经过衍生硅烷化，过程较复杂，液相色谱串联质谱法前处理相对简单，检测灵敏度高。虽然目前水产品中三苯甲烷染料和氯霉素类药物残留量的检测手段呈现多样化，但两类物质同时检测的方法未见报道，本文建立了水产品中三苯甲烷染料和氯霉素同时检测的方法，该方法在测定低限满足现行法规标准的要求的同时，提高了检测效率和降低了检测成本。

1 实验部分

1.1 仪器和材料

API 4000+型四极杆串联质谱仪，美国AB SCEIX公司，配岛津LC-30A超高效液相色谱仪，日本SHIMADZU公司；IKA T25高速均质机，德国IKA公司；常速离心机，上海安亭公司；KQ-600B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；N-EVAPTM112型氮吹浓缩仪，美国Organomatian Associates公司；SIG 560E型号旋涡混合器，美国Scientific Industries公司；Option-Q15型超纯水一体机，英国ELGA公司；固相萃取装置(美国Supelco公司)。

孔雀石绿草酸盐(Malachite green oxalate salt，CAS 2437-29-8)，隐性孔雀石绿(leucomalachite green，CAS 129-73-7)，结晶紫(Basic Violet 3，CAS 548-62-9)，隐性结晶紫(Leucoc rystal Violet，CAS 603-48-5)，氯霉素(Chloramphenicol，CAS 56-75-7)，甲砜霉素(Thiamphenicol，CAS 15318-45-3)氟甲砜霉素(Florfenicol，CAS 76639-94-6)，氘代氯霉素(Chloramphenicol-D5，CAS 202480-68-0)等标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。孔雀石绿同位素-D5，隐性孔雀石绿同位素-D6，购自上海安谱公司。甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；乙酸铵(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙酸(色谱纯，美国TEDIA公司)；中性氧化铝固相萃取小柱(美国Supelco公司)；水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm-1)。

1.2 仪器条件

1.2.1 三苯甲烷染料仪器条件

HPLC条件：色谱柱：Waters UPLC BEH RP C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流动相A：40 mmol·L-1乙酸铵(含2%乙酸)溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱：0～0.5 min，50% B，0.5～1.0 min，50%～95% B，1.0～3.0 min，90% B，3.0～3.5 min，90%～50% B，3.5～5.0 min，50% B，流速：0.2 mL·min-1，进样体积：5L，柱温：40 ℃。

MS条件：ESI正模式扫描，多反应监测(MRM)，雾化气压力(GS1)：20 psi，辅助气压力(GS2)：60 psi，气帘气压力(CUR)：40 psi，离子源温度：600 ℃，电喷雾电压(IS)：5 000 V，各化合物去簇电压(DP)和碰撞电压(CE)见表1。

表1 三苯甲烷染料化合物质谱参数

1.2.2 氯霉素类药物仪器条件

HPLC条件：色谱柱：Waters UPLC BEH RP C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流动相A：水，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0～1.0 min，30% B，1.0～2.0 min，30%～60% B，2.0～4.0 min，60%～90% B，4.0～4.1 min，90%～30% B，4.1～6.0 min，30% B，流速：0.2 mL·min-1，进样体积：5L，柱温：40 ℃。

MS条件：ESI负离子扫描，多反应监测(MRM)，雾化气压力(GS1)：50 psi，辅助气压力(GS2)：50 psi，气帘气压力(CUR)：10 psi，离子源温度(TEM)：500 ℃，电喷雾电压(IS)：-4 500 V，各化合物去簇电压(DP)和碰撞电压(CE)见表2。

表2 氯霉素类药物质谱参数

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取适量三苯甲烷染料标准品和内标物，用乙腈溶解配成1.0 mg·mL-1的标准储备液，用棕色玻璃瓶盛放，于-18 ℃下保存。准确称取适量氯霉素类标准品和内标物，用甲醇溶解配成100 μg·mL-1的标准储备液，用棕色玻璃瓶盛放，于-18 ℃下保存。分别移取适量的氯霉素类药物和三苯甲烷染料标准储备液，用乙腈逐级稀释成10、50、100 ng·mL-1的标准中间液。分别移取内标物储备液用，乙腈逐级稀释成100 ng·mL-1内标物中间液。

1.3.2 定容液和流动相的配制

40 mmol·L-1乙酸铵溶液：准确称取3.15 g乙酸铵，用纯水溶解并定容至1 000 mL；乙腈-40 mmol·L-1乙酸铵溶液(1+1，v:v)：准确量取50 mL乙腈，加入50 mL 40 mmol·L-1乙酸铵溶液，混合均匀；40 mmol·L-1乙酸铵(含2%乙酸)溶液：向998 mL 40 mmol·L-1乙酸铵溶液中加入2 mL乙酸，混合均匀。

1.3.3 样品前处理

称取试样5.0 g，置于50 mL聚丙烯离心管内，加入11 mL乙腈，高速均浆提取30 s，在4 500 r·min-1下离心5 min，上层清液转入25 mL比色管中，残渣中再加入11 mL乙腈，涡旋混合30 s，超声提取5 min，在4 500 r·min-1下离心5 min，合并上层清至25 mL比色管中，用乙腈定容，混合均匀后待净化。取5 mL提取液倒入经5 mL乙腈活化平衡的中性氧化铝小柱内，再用5 mL乙腈洗脱，收集全部流出液，洗脱液在45 ℃以下水浴，氮吹至干，残渣用2 mL定容液定容，超声溶解后过0.22 μm滤膜，供UHPLC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

蠕动泵将标准溶液泵入质谱仪，三苯甲烷染料在ESI正模式下有最佳的响应值，质谱全扫描获得MG和CV及其代谢物的分子峰[M+H]+，加上碰撞电压时，MG、CV及其代谢物，都会产生失去一个甲基和一个二甲基苯胺碎片离子。氯霉素类药物在负模式下扫描响应值较高，质谱全扫获得其分子峰[M-H]-，加上碰撞电压时，其结构中2-二氯乙酰胺基都易失去或发生结构重组。欧盟2002/675 EC指令规定，质谱确证方法需要4个确证点数，每个待物选择两对离子，作为定性离子，同位素内标物选择一对定量参比离子。确定扫描离子对后，联接液相进样，对质谱离子源参数进行优化，自动优化获得最佳电喷雾电压(IS)、雾化气压力(GS1)、辅助气压力(GS2)、气帘气压力(CUR)、离子源温度(TEM)。

2.2 色谱条件的选择

三苯甲烷染料和氯霉素类药物为中等极性到弱极性化合物，在反相色谱中均可保留，目前多数文献和标准方法均采用反相色谱进行分离[15-17]。三苯甲烷类药物正模式扫描，在流动相中加入一定挥发性酸能促进化合物的电离，可以提高灵敏度，而氯霉素类药物在负模式扫描，加入酸会抑制化合物的电离，导致响应值下降，两类化合物在同一色谱条件下进行分析，灵敏度比较难兼顾，因此本方法确定两类采用不同仪器条件进行分析检测。

实验比较了不同的色谱柱，发现Waters UPLC BEH RP C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)相比Waters UPLC HSS T3柱(50 mm×1.0 mm，1.8 μm)分离效果较好，化合物响应值更高，因此确定Waters UPLC BEH RP C18柱为本方法分析用色谱柱。

2.3 提取和净化条件的选择和优化

多数文献报道采用乙酸乙酯、乙腈等有机溶液提取水产品中氯霉素类药物，三苯甲烷染料及其代谢物[8，18-19]，本方法比较了乙腈和乙酸乙酯不同的提取效率，实验发现乙腈提取整体效率要做优于乙酸乙酯，尤其是LMG，乙酸乙酯提取回收率都在20%以下，而乙腈的提取回收率均在85%以上，TAP和MG用乙酸乙酯提取的回收率在50%以下，乙腈的提取回收率除鳗鱼的回收率略低于70%，在小龙虾和鲤鱼提取回收率都超过了80%，可能是因为鳗鱼中含油脂较多的原因，由于部分药物的极性相对较强，乙酸乙酯提取效率不高，乙酸乙酯提取的油脂较多，基质效应可能也影响了提取回收率，因此本方法确定乙腈作为提取溶剂。

水产品中三苯甲烷染料和氯霉素类药物残留量较低，样品在提取后需进行进一步纯化富集。液液萃取操作繁琐且有机溶剂消耗量大，冷冻除油净化[19]，固相萃取净化HLB柱[20-21]等净化方式均有相关报道，但两类药物同时纯化的处理方式未见报道。三苯甲烷染料和氯霉素类药物的极性跨度大，且三苯甲烷染料在水溶液中为阳离子，采用反相或离子交换作用机理的固相萃取方式，可能难以兼顾两类药物，本方法采用正相纯化的方式，以除去提取液共萃取油脂等非极性杂质。中性氧化铝柱是一种正相保留机理的固相萃取柱，能够吸附极性化合物，并去除油脂。本方法采用中性氧化铝柱净化，能够去除共萃取物中的油脂，同时对目标物不会产生死吸附，对比了不同品牌的中性氧化铝小柱，除品牌C的稳定性略差外，品牌间纯化效果的差异并不明显。同时考查了洗脱体积对回收率的影响，5 mL乙腈洗脱基本能将目标物全部洗脱下来，再增加5 mL乙腈洗脱未检出目标物，且浓缩后残渣有一些增加，考虑后续浓缩时杂质干扰的影响，洗脱体积确定为5 mL。

2.4 特异性

本方法用空白鳗鱼、小龙虾、鲤鱼样品与其对照加标样品，进行全过程实验，实验结果表明两类药物均具有良好的特异性，在目标物出峰处无干扰峰。

2.5 基质效应

基质效应是影响质谱法定量结果重要因素，本方法考查了基质效应对定量结果的影响，用空白基质溶液配制标准曲线与试剂配制标准曲线比较，通过计算基质标准曲线与试剂过原点标准曲线斜率比值的关系，确定基质效应。实验结果表明鳗鱼、小龙虾和鲤鱼基质中各化合物存在不同的基质效应作用，而且基质作用的强弱有所差异，三苯甲烷染料基质效应非常大，氯霉素类药物也存在一定的基质效应。在定量时采用同位素内标可以消除基质效应，但本方法所测定的7种化合物只有3种化合物有同位素内标，为有效消除基质效应，本方法确定采用基质标准曲线定量，孔雀石绿、隐性孔雀石绿、氯霉素采用同位素内标定量，其它4种化合物采用基质外标法定量。

2.6 测定低限和线性范围

用空白鳗鱼、小龙虾、鲤鱼加标实验，通过计算目标物的信噪比，以信噪比大于10的浓度确定定量限，三苯甲烷染料定量限为0.5 μg·kg-1，氯霉素定量限为0.1 μg·kg-1，甲砜霉素和氟甲砜霉素定量限为1.0 μg·kg-1。考查了基质标准曲线的线性范围，三苯甲烷染料在0.25～5.0 μg·kg-1，氯霉素在0.05～2.0 μg·kg-1，甲砜霉素和氟甲砜霉素在0.5～20.0 μg·kg-1浓度范围内呈线性关系，线性相关系数均在0.99以上。