荧光定量PCR在脑脊液结核分枝杆菌DNA检测中的应用价值分析

刘冬宇 郝艳霞

【摘要】

目的：对荧光定量PCR在脑脊液结核分枝杆菌DNA检测中的应用价值展开分析与探讨。方法：选择在我院接受检查的结核性脑膜炎患者91例和非结核性脑膜炎患者42例纳入本次研究，分别利用荧光定量PCR和改良罗氏培养法对研究对象的脑脊液样本进行检测，比较两种检测方法的检测结果。结果：荧光定量PCR和改良罗氏培养法对结核性脑膜炎患者脑脊液中结核分枝杆菌的检验阳性率分别为60.44%、16.48%，相较于改良罗氏培养法，荧光定量PCR对结核性脑膜炎患者脑脊液中结核分枝杆菌的阳性率更高（P<0.05）。结论：荧光定量PCR在脑脊液结核分枝杆菌DNA检测中的应用价值较高，可考虑将其广泛应用至临床对结核性脑膜炎的诊断当中。

【关键词】荧光定量PCR;脑脊液;结核分枝杆菌DNA;应用价值

【中图分类号】R4

【文献标识码】A

【文章编号】2095-6851（2020）04-143-01

结核性脑膜炎很容易被错误的诊断为化脓性脑膜炎、病毒性脑炎和脑肿瘤等疾病，且该疾病的病情发展速度较快、预后一般不佳，因此，寻找出一种可快速在早期明确诊断结核性脑膜炎的方法十分必要[1]。本研究旨在对荧光定量PCR在脑脊液结核分枝杆菌DNA检测中的应用价值展开分析与探讨，研究详情如下。

1研究对象及方法

1.1研究对象

选择在我院接受检查的结核性脑膜炎患者91例和非结核性脑膜炎患者42例纳入本次研究，研究对象选取时间范围为2017年2月至2019年4月，91例结核性脑膜炎患者中62例为男性、29例为女性，年龄最大的75岁，年龄最小的3个月，年龄均数（39.07±16.35）岁;42例非结核性脑膜炎患者中27例男性、15例女性，年龄最大的74岁，年龄最小的5个月，年龄均数（38.54±15.83）岁，统计学分析结果显示两组研究对象基本情况未见有明显差别，临床表现可见为均衡性（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1仪器和试剂

本研究分别对产自湖南圣湘生物科技有限公司的荧光定量PCR检测试剂、德国QIAGEN公司的Rotor-Gene Q荧光定量PCR仪和依据国际防痨和肺病联合会推荐配方自行配置的改良罗氏培养基进行了应用。

1.2.2荧光定量PCR

利用震荡方法将500uL脑脊液和200uL浓缩液混匀，并进行每分钟8000r持续3分钟的离心，吸除上清液后加入无菌生理盐水1ml重悬沉淀，再进行每分钟8000r持续3分钟的离心，吸除上清液后留沉渣备用。于沉渣中加入核酸释放剂50ul，反复吸打混匀后静置2-3分钟。把38uLPCR反應液、1uL内标、2uL酶结合物和5uL制备好的样本加入PCR反应管中，经45个15秒94℃、30秒57℃循环后进行10秒25℃延伸，以使之得到充分反应。若Ct值超过39的样本同时显示为内标阳性则认定为阴性;若Ct值不足39且曲线呈现标准的S形则认定为阳性。

1.2.3改良罗氏培养法

在2ml脑脊液中加入2倍量35g/L氢氧化钠处理液，充分震荡并放置于37℃的水浴箱中15分钟，期间进行2次震荡后对标本进行每分钟3000r持续10分钟的离心，将上清液吸去保留沉淀物。于罗氏培养基中接种0.1ml沉淀物并将其置入36℃孵育箱，分别于第3、7、14、21、28、35、42、49、56天进行观察，若经涂片抗酸染色确认有菌落生长则为阳性，无菌落生长视为阴性。

1.3评估依据

比较荧光定量PCR和改良罗氏培养法对结核性脑膜炎患者及非结核性脑膜炎患者脑脊液的检测结果。

1.4统计分析

使用X2检验计数资料，若结果为P<0.05，则代表数据间差异统计学意义明显，所有数据的统计皆经由SPSS19.0软件完成。

2结果

下表1显示，荧光定量PCR和改良罗氏培养法对结核性脑膜炎患者脑脊液中结核分枝杆菌的检验阳性率分别为60.44%、16.48%，相较于改良罗氏培养法，荧光定量PCR对结核性脑膜炎患者脑脊液中结合分枝杆菌的阳性率更高（P<0.05）。荧光定量PCR和改良罗氏培养法对非结核性脑膜炎患者脑脊液中结核分枝杆菌的检验结果皆呈阴性（P>0.05）。

3讨论

在所有结核病当中，结核性脑膜炎是严重程度最高的一种肺外结核病型，有统计结果显示，三成左右的结核性脑膜炎患者会在接受抗结核治疗后死亡，特别是儿童，对结核性脑膜炎进行早期确诊和及时治疗是对患者疾病预后进行改善的一项重要手段[2]。

MTB培养法是临床对结核病进行诊断的金标准，具有特异性高、精准、可靠的特点，但一般需对检验标本进行4-8周的培养才能获得结果，且仅活菌才能被培养出来，使结核病患者难以在疾病早期得到准确诊断，耽误其及时接受对症治疗[3]。为寻找出一种更为理想的结核菌检测方法，本研究分别对91例结核性脑膜炎患者与42肺结核性脑膜炎患者的脑脊液进行了荧光定量PCR和改良罗氏培养法，所得结果显示：荧光定量PCR对结核性脑膜炎患者脑脊液中结核分枝杆菌的检验阳性率为60.44%，明显高于改良罗氏培养法的16.48%，在很大程度上证明了荧光定量PCR在检测脑脊液结核分枝杆菌中的临床价值。

可见，荧光定量PCR在脑脊液结核分枝杆菌DNA检测中的应用价值较高，可考虑将其广泛应用至临床对结核性脑膜炎的诊断当中。

参考文献：

[1]吴利，葛章文，廖萍.荧光定量PCR检测技术在结核诊断中的应用探讨[J].临床医药文献电子杂志，2019，6（8）：155-156.

[2]谭珂，孙炳奇.荧光定量PCR检测技术在结核诊断中的应用探讨[J].中国医疗器械信息，2018，24（4）：7-8.

[3]王俊妨，靳颖，牛伟霞， 等.荧光定量PCR在脑脊液结核分枝杆菌DNA检测中的应用[J].检验医学，2017，32（2）：135-137.